李 雯，成 翔，秦建兵，田美玲，何 輝，趙荷艷，金國華*

(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系，神經(jīng)生物學(xué)研究所，南通 226001)

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，存在于發(fā)育中的大腦和成年哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中[1]。NSCs 通過產(chǎn)生神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞(中樞神經(jīng)系統(tǒng)的3 種主要細(xì)胞類型)來促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。在成人腦損傷和神經(jīng)退行性疾病的治療中，通過促進(jìn)NSCs 分化來代償疾病丟失的神經(jīng)元具有潛在的應(yīng)用前景[2]。我們先前的研究[3]表明，切斷基底前腦隔區(qū)神經(jīng)元向海馬的投射纖維后，海馬齒狀回門區(qū)和顆粒下層自體NSCs 表現(xiàn)出強(qiáng)大的增殖能力和神經(jīng)元分化特征，這與顆粒下層原本處于靜息狀態(tài)的NSCs 被激活密切相關(guān)。外泌體是一類直徑在40～150 nm 之間的細(xì)胞外微囊泡，在過去的10 余年中受到了科學(xué)的關(guān)注[4]。最近，從哺乳動物細(xì)胞釋放的外泌體被報道為一種細(xì)胞間通信的新載體，因為它可將脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、mRNA、非編碼RNA 甚至DNA 轉(zhuǎn)運(yùn)到其他細(xì)胞，在各種干細(xì)胞微環(huán)境中發(fā)揮重要作用[5]。在此背景下，我們利用高通量測序技術(shù)檢測去膽堿能神經(jīng)支配后海馬外泌體內(nèi)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)切割組外泌體中miR-219a-1-3p 顯著下調(diào)。為了更好地研究miR-219a-1-3p 與海馬外泌體促進(jìn)NSCs 向神經(jīng)元分化之間的關(guān)系，本研究應(yīng)用實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction,Realtime PCR)、Western Blot 和免疫熒光等方法，對海馬外泌體miR-219a-1-3p 的下調(diào)進(jìn)行了驗證，并檢測了miR-219a-1-3p 在大鼠全身多組織、細(xì)胞的表達(dá)情況以及對NSCs 分化為神經(jīng)元的影響，為更好地研究NSCs 的分化提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 實驗所用胚齡15 d SD 大鼠和220～250 g 成年SD 大鼠由南通大學(xué)實驗動物中心提供[動物許可證編號：SYXK(蘇)2012-0031]。動物實驗由南通大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，并按照實驗動物飼養(yǎng)管理和使用指南進(jìn)行。實驗過程中盡可能減少實驗動物使用數(shù)量，減輕實驗動物痛苦。用復(fù)合麻醉劑Chlorpent(0.2 mL/100 g 體質(zhì)量)麻醉大鼠后行穹隆海馬傘切割術(shù)，無菌條件下切開顱頂部皮膚，分離骨膜以充分暴露前囟，記錄前囟A(矢狀軸)、L(冠狀軸)和V(垂直軸)的坐標(biāo)，參照Paxinos《大鼠腦立體定位圖譜》確定雙側(cè)穹窿海馬傘的切割范圍。先在顱骨上確定左側(cè)兩點，即(1)A1=A-1.4、L1=L+1和(2)A2=A-1.4、L2=L+4，再確定右側(cè)兩點，即(3)A3=A-1.4、L3=L-1 和(4)A4=A-1.4、L4=L-4；然后用顱骨鉆在每點位置各鉆一小孔，(1)、(2)和(3)、(4)兩點間用刀片分別劃開一條骨縫，將針刀插入腦內(nèi)，深度為V=V+5.4，針刀來回切割3 次后退出，待無明顯出血后用骨蠟封閉骨縫。最后，縫合皮膚，肌注青霉素，放回籠內(nèi)飼養(yǎng)。

1.2 海馬微環(huán)境總外泌體提取 切割術(shù)后7 d，無菌條件下依次剝離大腦表面被膜和血管，分離并提取海馬組織，加入2 mL 0.125%的胰蛋白酶，輕輕吹打成勻液，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，加入0.1 mol/L(pH 7.4)磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)復(fù)懸至30 mL，4 ℃3 000 g 離心30 min以除去碎片，將上清液轉(zhuǎn)移至新的50 mL 離心管；用220 nm 濾器過濾上清至30 ku 超濾管中，將濃縮上清液轉(zhuǎn)移至EP 管中，加入等體積的Total Exosome Isolation 試劑，渦旋混勻，4 ℃過夜；將樣品以4 ℃10 000 g 離心1 h，棄上清，加入適當(dāng)體積PBS 將沉淀重懸。部分外泌體標(biāo)本送上海烈冰生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行RNA-seq 檢測。

1.3 胚胎海馬NSCs 分離培養(yǎng)及體外誘導(dǎo)分化 胚齡15 d SD 大鼠，腹腔注射復(fù)合麻醉劑，無菌條件下取出胚胎，置于基礎(chǔ)培養(yǎng)液(無血清DMEM)中，分離出海馬，機(jī)械解離成單細(xì)胞懸液，離心后棄上清，用增殖培養(yǎng)液[DMEM/F12 1∶1,2% B27,20 ng/mL 堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF),20 ng/mL 表皮細(xì)胞生長因子(epidermal growth factor,EGF)]重懸，以密度(2～5)×105個細(xì)胞/T25 培養(yǎng)瓶種植。6～7 d 后將形成的神經(jīng)球消化傳代，種植于分化培養(yǎng)液[DMEM/F12 1∶1,2% B27,2%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)]中誘導(dǎo)分化，密度為5×104個細(xì)胞/mL，貼壁過夜后換液，將正常組和切割組海馬外泌體分別與NSCs 共培養(yǎng)，或分別將miR-NC 和miR-219a-1-3p mimic 轉(zhuǎn)染至NSCs 中進(jìn)行誘導(dǎo)分化。

1.4 神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng) 胚齡15 d SD 大鼠，腹腔注射復(fù)合麻醉劑，無菌條件下取出胚胎，置于基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，分離出大腦皮質(zhì)，機(jī)械解離成單細(xì)胞懸液，離心后棄上清，培養(yǎng)神經(jīng)元用神經(jīng)元培養(yǎng)液(neurobasal,2 mmol/L 賴氨酸,2%B27)重懸，以密度2.8×106個細(xì)胞/10 cm 培養(yǎng)皿種植，6～7 d 后收集細(xì)胞提取RNA；培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞用星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM/F12 1∶1,10%FBS)重懸，3～4 d 后傳代，傳至第4 代時收集細(xì)胞提取RNA。

1.5 Real-time PCR 取3 只成年SD 大鼠，麻醉后取端腦、小腦、腦干、海馬、心臟、肝臟和肌肉組織，分別用研磨器在Trizol 中研磨提取RNA；培養(yǎng)的細(xì)胞則用Trizol 直接裂解，提取總RNA。按照HiScript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)第一鏈cDNA合成試劑盒(Vazyme Biotech 公司)說明書將1 μg 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照Fast Start Universal SYBR Green Master(Roche)說明書，在StepOnePlusTMrealtime PCR 儀(Applied Biosystems 公司)中進(jìn)行Realtime PCR，數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗所用引物由Sangon Biotech 和RiboBio 公司設(shè)計。

1.6 Western Blot 用蛋白提取試劑盒(Pierce 公司)提取細(xì)胞總蛋白，測定濃度后進(jìn)行凝膠電泳，Bio-Rad 半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉將膜室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜。次日二抗室溫孵育2 h，通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(Bio-Rad 公司)進(jìn)行顯像。用Shine-tech Image System 掃描并量化每個條帶的光密度值。實驗所用一抗：鼠抗Tuj1 單克隆抗體(1∶1 000,Millipore 公司)，鼠抗β-actin 單克隆抗體(1∶1 500,Abcam 公司)；二抗：辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000,Pierce 公司)。

1.7 細(xì)胞免疫熒光 細(xì)胞爬片經(jīng)4%多聚甲醛室溫固定30 min，用含有0.3%Triton X-100 和0.5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的0.01 mol/L PBS(pH7.4)室溫封閉2 h，加入一抗4 ℃過夜。次日用二抗在室溫下避光孵育2 h。細(xì)胞核用Hoechst33342(1∶1 000,Pierce 公司)復(fù)染，PBS 清洗后甘油封片。實驗所用一抗為鼠抗Tuj1 單克隆抗體；二抗為Alexa Fluor 488 綴合的(綠色)山羊抗鼠IgG(1∶1 000,Abcam公司)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠海馬外泌體促進(jìn)NSCs 向神經(jīng)元分化 為了探究海馬組織外泌體在NSCs 分化中所起的作用，本實驗分別用Real-time PCR、Western Blot 和細(xì)胞免疫熒光進(jìn)行檢測。Real-time PCR 檢測關(guān)鍵的神經(jīng)元特異分子，結(jié)果顯示，共培養(yǎng)24 h 后切割組Map2、Neurod1、Stmn2 和Syn1 表達(dá)開始顯著上調(diào)(圖1A，見封三)。Western Blot 結(jié)果表明，切割組Tuj1 蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)(圖1B，見封三)。細(xì)胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)切割組Tuj1 陽性神經(jīng)元比例明顯上調(diào)(圖1C，見封三)，據(jù)此認(rèn)為切割組海馬組織外泌體可促進(jìn)NSCs 向神經(jīng)元分化。

2.2 大鼠海馬外泌體RNA-seq 及驗證 外泌體RNA 測序顯示有24 個差異表達(dá)的miRNA，其中9個上調(diào)，15 個下調(diào)(圖2A～B)。Real-time PCR 結(jié)果顯示，與正常海馬外泌體相比，切割組外泌體中miR-219a-1-3p 表達(dá)下調(diào)(圖2C)。

2.3 miR-219a-1-3p 在大鼠多組織細(xì)胞中的表達(dá)Real-time PCR 檢測miR-219a-1-3p 在成年大鼠的端腦、小腦、腦干、海馬、心臟、肝臟和肌肉組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-219a-1-3p 在端腦和海馬中的表達(dá)顯著高于其他組織，且在端腦中表達(dá)最高(圖3A)。Real-time PCR 檢測miR-219a-1-3p 在NSCs、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果如圖3B 所示，miR-219a-1-3p 在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)最低，在NSCs 中表達(dá)最高。

2.4 miR-219a-1-3p 對NSCs 向神經(jīng)元分化的影響為了探究miR-219a-1-3p 在NSCs 分化中的作用，我們用mimic 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，Real-time PCR 檢測其過表達(dá)效率，結(jié)果顯示，過表達(dá)組miR-219a-1-3p 水平顯著上調(diào)(圖4A，見封三)。接著對Map2、Neurod1、Stmn2 和Syn1 進(jìn)行分析，結(jié)果表明4 個關(guān)鍵的神經(jīng)元特異分子均顯著下調(diào)(圖4B，見封三)。如圖4C(見封三)所示，在miR-219a-1-3p 過表達(dá)組中，Tuj1 蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)。免疫熒光分析顯示，過表達(dá)組的Tuj1 陽性細(xì)胞少于對照組(圖4D，見封三)。總之，這些結(jié)果表明miR-219a-1-3p 過表達(dá)抑制了NSCs 分化為神經(jīng)元。

3 討 論

神經(jīng)可塑性即損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)自我修復(fù)的能力，強(qiáng)烈依賴于神經(jīng)發(fā)生[6-7]，假如能夠找到有效的方法促進(jìn)海馬內(nèi)源性神經(jīng)元再生與分化，或通過外源性手段補(bǔ)充丟失的神經(jīng)元，就可促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)，從而有效預(yù)防和治療各種疾病所致的認(rèn)知功能障礙。海馬齒狀回的顆粒下層在整個生命過程中都有神經(jīng)發(fā)生的潛力[8]。本課題組先前的研究[3]表明，切割穹窿海馬傘阻斷隔區(qū)神經(jīng)纖維向海馬齒狀回的投射后，海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)局部微環(huán)境的改變在一定時間內(nèi)為NSCs 的存活、增殖和向神經(jīng)元分化提供了有利條件。

外泌體是細(xì)胞外囊泡的亞型，具有獨特的結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)功能。鑒于外泌體在細(xì)胞間通訊中可作為介質(zhì)傳遞重要蛋白[9]、小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)[10]和微小RNA(microRNA,miRNA)[11-14]，調(diào)節(jié)淀粉樣蛋白前體(amyloid precursor proteins,APP)和tau 蛋白的表達(dá)和功能，提示外泌體具有在臨床前階段用作診斷的生物標(biāo)志物的潛力以及它們用于調(diào)節(jié)神經(jīng)變性的可能性[15]。自從2007年首次報道外泌體以來，外泌體來源的RNA 研究迅速增加。研究[16]表明，外泌體及其供體細(xì)胞的RNA 譜存在顯著差異。如致癌的miR-21 表達(dá)通過外泌體被上調(diào)和分泌，從而促進(jìn)了許多惡性腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[17]。

本研究將海馬的外泌體與NSCs 共培養(yǎng)，觀察它們對NSCs 分化的影響。結(jié)果表明，NSCs 與切割組去神經(jīng)支配的海馬外泌體一起孵育，可促進(jìn)更多的NSCs 分化為神經(jīng)元。利用高通量測序技術(shù)觀察去神經(jīng)支配后海馬外泌體內(nèi)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)變化，結(jié)果顯示共有24 個miRNA 表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄激活狀態(tài)。鑒于在發(fā)育過程中miRNA 的表達(dá)受到調(diào)控，表現(xiàn)為在某一組織和細(xì)胞類型中富集，因此我們選取了發(fā)育自3個胚層的7 種組織及NSCs、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞檢測差異miRNA 的表達(dá)水平。盡管在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)水平低的miRNA 也可能具有功能，但我們認(rèn)為高表達(dá)的miRNA 更有可能在神經(jīng)生物學(xué)過程中起著至關(guān)重要的作用，因此主要關(guān)注miR-219a-1-3p。接著在海馬NSCs 中過表達(dá)miR-219a-1-3p，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-219a-1-3p 抑制了NSCs 向神經(jīng)元的分化，該結(jié)果和切割組外泌體(較正常組外泌體中的miR-219a-1-3p 明顯下調(diào))與NSCs 共培養(yǎng)獲得的促進(jìn)NSCs 向神經(jīng)元分化的結(jié)果一致。

圍繞本研究尚需要進(jìn)一步探討的問題還有miR-219a-1-3p 靶向于調(diào)控NSCs 分化的mRNAs有哪些？相關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑是什么？miR-219a-3p對NSCs 分化為特定表型神經(jīng)元(如膽堿能神經(jīng)元)有什么影響？外泌體中還有哪些非編碼RNA 與NSCs向神經(jīng)元的分化有關(guān)等。闡述這些問題將為揭示NSCs 分化機(jī)制和將外泌體應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病的治療提供線索和新思路。