張海洋　付嬈　李茹霞　顧寅鈺　梁曉艷　邢延富　李萌　宋延靜　王向譽(yù)　郭洪恩

摘要：為篩選適宜菠菜不同脅迫下基因表達(dá)水平分析的內(nèi)參基因，本研究選取ACT11、ACT2/7、G6PD、ELF1B、UBC2、TUB、TUA和CYP2共8個(gè)常用內(nèi)參基因作為候選內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，通過(guò)geNorm、NormFinder、BestKeeper軟件分析和評(píng)價(jià)其在不同脅迫下菠菜幼苗中的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果表明，8個(gè)候選內(nèi)參基因在不同脅迫處理下菠菜幼苗中的表達(dá)豐度及穩(wěn)定性存在差異，NaCl和高溫脅迫下G6PD表達(dá)穩(wěn)定性最好，PEG脅迫下ELF1B表達(dá)穩(wěn)定性最好。本研究結(jié)果可為菠菜非生物脅迫下相關(guān)基因的功能分析和基因差異表達(dá)研究提供有效的校正工具。

關(guān)鍵詞：菠菜;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;非生物脅迫;內(nèi)參基因

中圖分類號(hào)：S636.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2020）05-0021-05

Abstract In order to select appropriate reference genes for accurate analysis of expression level of target genes in spinach， eight commonly used internal genes （ACT11， ACT2/7， G6PD， ELF1B， UBC2， TUB， TUA and CYP2） were selected as candidates to analyze and evaluate their expression stability in spinach under different stresses through geNorm， NormFinder， BestKeeper， and real-time fluorescent quantitative PCR technology. The results showed that the expression abundance and stability of the 8 candidate internal reference genes were different under different stress treatments. The expression stability of G6PD was the best under NaCl stress and high temperature stress. The expression stability of ELF1B was the best under PEG stress. The results could provide effective correction tools for the functional analysis of related genes under abiotic stresses and the study of gene differential expression in spinach.

Keywords Spinach; Real-time fluorescent quantitative PCR; Abiotic stresses; Reference gene

菠菜（Spinacia oleracea L.） 屬藜科菠菜屬，為常見(jiàn)綠葉蔬菜，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的一年生草本植物[1，2]。它是維生素和礦物質(zhì)的重要來(lái)源，富含類胡蘿卜素、維生素C、維生素K、葉酸、鐵和鈣等，常用于制作沙拉、熟食等。目前，菠菜研究主要集中在栽培技術(shù)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、加工開(kāi)發(fā)等方面，但隨著菠菜基因組測(cè)序的成功[2]和生物技術(shù)的發(fā)展，其功能基因的克隆表達(dá)及基因組學(xué)等研究也日益廣泛，其中利用分子生物學(xué)技術(shù)闡明菠菜相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)理將成為研究重點(diǎn)。

基因表達(dá)量檢測(cè)是進(jìn)行相關(guān)基因功能研究的前提，內(nèi)參基因作為檢測(cè)基因表達(dá)量變化的參照，對(duì)其進(jìn)行篩選研究具有重要意義。內(nèi)參基因通常為管家基因，在各細(xì)胞和組織中的表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，試驗(yàn)中需要利用內(nèi)參基因?qū)δ繕?biāo)基因表達(dá)水平檢測(cè)進(jìn)行校正，而其穩(wěn)定性對(duì)RT-qPCR結(jié)果的準(zhǔn)確性具有決定性影響[3，4]。理想的內(nèi)參基因應(yīng)穩(wěn)定表達(dá)于不同組織和細(xì)胞中，且表達(dá)量不受內(nèi)源性或外源性因素的影響。一些維持正常生命代謝所必需的持家基因，比如18S rRNA、組蛋白（Histone）基因、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）、肌動(dòng)蛋白基因（Actin）等常被用作內(nèi)參[5]。越來(lái)越多研究表明，不同的植物組織和試驗(yàn)處理中，這類基因的表達(dá)量并不恒定。因此，在RT-qPCR分析中有必要對(duì)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并選出適合的內(nèi)參基因[6]。相關(guān)研究者基于RT-qPCR分析中基因表達(dá)的CT值，開(kāi)發(fā)了一系列專門(mén)用于分析內(nèi)參基因穩(wěn)定性的程序，目前應(yīng)用最多的有g(shù)eNorm、NormFinder和BestKeeper[7-9]。這3款軟件的工作原理各不相同，因此常常將三者配合起來(lái)用于評(píng)估候選基因的穩(wěn)定性。本試驗(yàn)選取ACT11、ACT2/7、G6PD、ELF1B、UBC2、TUB、TUA、CYP2作為候選內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)并通過(guò)geNorm、NormFinder、BestKeeper軟件分析和評(píng)價(jià)該類基因在不同條件下菠菜中的表達(dá)穩(wěn)定性，以期篩選出相對(duì)適宜的內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菠菜品種為課題組保存的山東小葉菠菜。播種于山東省蠶業(yè)研究所植物光照培養(yǎng)箱中，待幼苗長(zhǎng)至四葉一心時(shí)，分別置于正常條件及NaCl、高溫、PEG條件下進(jìn)行處理，重復(fù)3次。選取處理后0、3、6、12 h苗期嫩株為樣品，經(jīng)液氮速凍后，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取與cDNA合成

采用Trizol法[10]提取總RNA。具體操作步驟：向處理過(guò)的1.5 mL離心管中加入1 mL Trizol，取菠菜組織在液氮中迅速研磨成粉末，加入上述離心管中（植物組織粉末的體積和Trizol的體積是1∶2），漩渦振蕩混勻，靜置5 min;向離心管中加入氯仿200 μL，漩渦振蕩混勻15 s，靜置2～3 min后，12 000 r/min、4℃離心15 min;將上清移入去RNase的離心管中，約500 μL;管中加入等體積異丙醇，輕輕混勻，靜置10 min后，12 000 r/min、4℃離心10 min;倒掉上清，向沉淀中加入75%乙醇1 mL，將沉淀輕輕打起，7 500 r/min、4℃離心5 min;倒掉上清，將離心管置于干凈工作臺(tái)上晾5～10 min;加入100 μL去RNase的ddH2O，輕輕振蕩使沉淀溶解，-80℃保存。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000檢測(cè)RNA質(zhì)量以確?？俁NA的完整性和濃度。

參照TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA第一鏈合成，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)和RT-qPCR分析

根據(jù)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，利用Primer Premier 6對(duì)8個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，委托北京六合華大基因科技有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

RT-qPCR擴(kuò)增選用熒光定量專用試劑盒TranStart Top Green qPCR SuperMix（+DyeⅡ）（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。反應(yīng)體系（20 μL）：qPCR SuperMix（2×）10 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，cDNA 1μL，ddH2O 7μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s，60℃退火30 s，44個(gè)循環(huán);擴(kuò)增完全后溫度從65℃緩慢上升至95℃進(jìn)行熔解曲線繪制，上升速度為每0.05 s上升0.5℃。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，內(nèi)參穩(wěn)定性評(píng)價(jià)軟件geNorm、NormFinder和BestKeeper進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選內(nèi)參基因特異性擴(kuò)增分析

以菠菜幼苗總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用RT-qPCR擴(kuò)增各候選內(nèi)參基因片段，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示，在100～250 bp之間均存在較亮的特異性條帶，與預(yù)期片段大小一致。說(shuō)明擴(kuò)增反應(yīng)具有較高的專一性，可用于熒光定量PCR分析。

2.2 內(nèi)參基因引物熔解曲線分析

以菠菜cDNA 為模板，8個(gè)候選內(nèi)參基因經(jīng)RT-qPCR擴(kuò)增后的熔解曲線如圖2所示，可知，8個(gè)候選內(nèi)參基因引物特異性良好，均為單峰，樣品間擴(kuò)增曲線重復(fù)性強(qiáng)。

2.3 候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析

2.3.1 geNorm軟件分析利用geNorm 軟件計(jì)算8 個(gè)候選內(nèi)參基因在不同脅迫條件下的表達(dá)穩(wěn)定值（M），M值越小基因表達(dá)越穩(wěn)定。分析結(jié)果（表2）顯示，菠菜NaCl脅迫處理下不同內(nèi)參基因的M 值排序?yàn)镚6PD

2.3.2 NormFinder軟件分析

利用NormFinder軟件計(jì)算8 個(gè)候選內(nèi)參基因在不同脅迫條件下的表達(dá)穩(wěn)定值（S），S值越小基因表達(dá)越穩(wěn)定。由表3可以看出，NaCl脅迫條件下8個(gè)候選內(nèi)參基因S值排序?yàn)镚6PD

2.3.3 BestKeeper軟件分析

BestKeeper 軟件直接利用CT 值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， R值趨近于1， SD值越小，說(shuō)明該基因穩(wěn)定性越好。由表4可以看出， NaCl和高溫脅迫下G6PD的R值趨近于1，相關(guān)性好，且 SD 值最小，說(shuō)明該類下G6PD適合作為內(nèi)參基因;NaCl脅迫處理?xiàng)l件下TUB 的SD 值最高，且大于1，穩(wěn)定性最差，不適合作為內(nèi)參基因;PEG脅迫下，ELF1B R值最高，SD值較低，說(shuō)明其相關(guān)性和穩(wěn)定性最好，適合作為內(nèi)參基因。該分析結(jié)果與geNorm 和NormFinder軟件的結(jié)果一致。

綜合上述3個(gè)軟件的分析結(jié)果，NaCl和高溫脅迫下G6PD表達(dá)穩(wěn)定性最好，PEG脅迫下ELF1B表達(dá)穩(wěn)定性最好。

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序及轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的快速發(fā)展，實(shí)時(shí)定量PCR已經(jīng)成為基因表達(dá)水平變化研究的重要技術(shù)手段。葉新如等[11]認(rèn)為內(nèi)參基因穩(wěn)定性的篩選與分析，是保證重要功能基因表達(dá)分析結(jié)果準(zhǔn)確性的重要前提[11]。因此，選擇合適的內(nèi)參基因就成為基因表達(dá)定量分析中需要考慮的首要問(wèn)題。研究表明，最適候選內(nèi)參基因在不同物種、組織和處理?xiàng)l件下的表達(dá)水平存在差異[12-15]。譚枝群[12]通過(guò)分析狗牙根葉片和根系在鹽、干旱、低溫和高溫脅迫下候選內(nèi)參基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，各基因表達(dá)量在不同組織中或脅迫條件下均存在差異。Wang等[13]證實(shí)鹽脅迫下，胡楊中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因TUB在相同脅迫條件下的菠菜中表達(dá)穩(wěn)定性較差。吳林軍[14]發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下，毛竹不同葉片中eIF-4α是表達(dá)最穩(wěn)定的基因，不同組織中eIF-4α或TIP41則是最適合的內(nèi)參基因。張佳佳等[15]發(fā)現(xiàn)低溫條件下，香樟CcACTc基因的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，而在干旱、高鹽、ABA條件下，CcEF1α基因的表達(dá)較穩(wěn)定。低溫脅迫下，Actin 基因在豆科屬植物檸條錦雞兒[16]中表達(dá)較為穩(wěn)定，但在茄科植物馬鈴薯[17]中表達(dá)穩(wěn)定性最差。干旱脅迫下，柳枝稷[18]和油菜[19]中Actin 基因的表達(dá)穩(wěn)定性相差較大。ABA脅迫下，水芹[20]和檸條錦雞兒[16]中EF1α 基因表達(dá)穩(wěn)定性較高，但在短柄草[21]中的表達(dá)較不穩(wěn)定。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的穩(wěn)定內(nèi)參基因ACT在菠菜不同脅迫下表達(dá)穩(wěn)定性不高。這與前人在其它物種上的研究結(jié)果類似[12-21]。因此，不同物種和脅迫條件下，ACT不是最穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。

為了減少內(nèi)參基因選擇的誤差，本研究采用RT-qPCR技術(shù)結(jié)合分子生物學(xué)軟件geNorm、NormFinder和BestKeeper對(duì)候選內(nèi)參基因在不同脅迫條件下菠菜中的穩(wěn)定性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同脅迫條件下的8個(gè)候選內(nèi)參基因在不同時(shí)段均有表達(dá)，但表達(dá)量存在差異，其中G6PD在NaCl和高溫脅迫下的表達(dá)穩(wěn)定性最好，而ELF1B在PEG脅迫處理下的表達(dá)穩(wěn)定性最好。本研究結(jié)果可為菠菜實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的選擇提供參考，并為菠菜功能基因的表達(dá)分析奠定理論基礎(chǔ)。

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