田 華，楊永國，梅 霞

食管癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，鱗狀細胞癌是食管癌最常見的組織學類型。研究表明，惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅取決于腫瘤細胞本身，而且腫瘤內的間質微環(huán)境在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要作用。podoplanin是淋巴管內皮細胞標志物，因其在微淋巴管密度及淋巴管癌栓判斷中具有重要價值而廣泛用于外科病理診斷中。有研究發(fā)現，podoplanin不僅標記淋巴管內皮細胞，而且在食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)腫瘤細胞和間質細胞中也有表達，但相關報道較少。本文應用免疫組化EnVision法檢測150例ESCC中podoplanin的表達，著重探討podoplanin在ESCC腫瘤細胞和間質細胞中表達的相關性及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016～2018年江蘇省江都人民醫(yī)院病理科150例ESCC手術切除標本。所有病例術前均未行任何放、化療。150例ESCC中男性102例，女性48例，年齡51～80歲，平均68歲。腫瘤最大直徑<4 cm者97例，≥4 cm者53例。腫瘤分化程度：高分化9例、中分化107例、低分化34例。腫瘤浸潤深度：T1期26例、T2期44例、T3期80例；有淋巴結轉移者60例，無淋巴結轉移者90例；有脈管侵犯者44例，無脈管侵犯者106例；神經侵犯者35例，無神經侵犯者115例；pTNM分期根據AJCC第8版分期：Ⅰ期37例，Ⅱ期55例，Ⅲ期57例，Ⅳ期1例。

1.2 免疫組化所有標本均經10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。免疫組化采用EnVision法，具體操作步驟根據試劑盒說明書進行。抗原修復采用高壓鍋高溫、高壓抗原修復，抗原修復液為枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)。一抗podoplanin鼠抗人單克隆抗體(D2-40，即用型)，購自北京中杉金橋公司。采用腫瘤組織內的淋巴管內皮細胞作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判斷podoplanin在間質梭形細胞中呈胞質陽性，當podoplanin在間質梭形細胞中陽性率>10%時判定為陽性。podoplanin在腫瘤細胞中陽性定位于細胞質伴/不伴胞膜陽性，當陽性率≥5%判定為陽性。

1.4 統(tǒng)計學分析所有數據均采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。腫瘤細胞和間質細胞中podoplanin表達與ESCC臨床病理特征的關系采用χ2檢驗，腫瘤細胞和間質細胞中podoplanin表達的相關性采用Spearmann相關分析。

2 結果

2.1 ESCC間質細胞和腫瘤細胞中podoplanin表達與臨床病理特征的關系podoplanin在ESCC間質細胞中陽性定位于細胞質，腫瘤細胞中陽性定位于細胞膜和細胞質，而且主要位于癌巢周圍的腫瘤細胞中(圖1、2)。間質細胞中podoplanin表達隨腫瘤浸潤深度增加而陽性率也增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；伴淋巴結轉移和脈管侵犯ESCC的間質細胞中podoplanin表達明顯高于無淋巴結轉移和脈管侵犯者(P<0.05)；pTNM分期Ⅲ+Ⅳ期ESCC的間質細胞中podoplanin表達明顯高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.01)；而間質細胞中podoplanin表達與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度和神經侵犯均無關(P>0.05)。podoplanin在ESCC腫瘤細胞中的陽性率為33.3%(50/150)，podoplanin在有淋巴結轉移、脈管侵犯和Ⅲ+Ⅳ期ESCC腫瘤細胞中表達明顯高于無淋巴結轉移、無脈管侵犯和Ⅰ+Ⅱ期ESCC，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而腫瘤細胞中podoplanin表達與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度以及神經侵犯均無關(P>0.05，表1)。

圖1 ESCC間質細胞中 podoplanin的表達，EnVision法
圖2 ESCC腫瘤細胞中 podoplanin的表達，EnVision法

表1 ESCC間質細胞和腫瘤細胞中podoplanin表達與臨床病理特征的關系

2.2 ESCC間質細胞和腫瘤細胞中podoplanin共表達與臨床病理特征的關系150例ESCC中，podoplanin在間質細胞和腫瘤細胞共陽性者44例，陽性率為29.3%(圖3)。間質細胞和腫瘤細胞中podoplanin共表達與ESCC淋巴結轉移、脈管侵犯、神經侵犯和pTNM分期密切相關(P<0.05)；與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度和浸潤深度均無關(P>0.05，表2)。

圖3 ESCC腫瘤細胞和間質細胞中 podoplanin的表達，EnVision法

表2 ESCC間質細胞和腫瘤細胞中podoplanin共陽性與臨床病理特征的關系

2.3 ESCC間質細胞和腫瘤細胞中podoplanin表達的相關性50例腫瘤細胞podoplanin陽性患者中，間質細胞podoplanin陽性者44例；100例腫瘤細胞podoplanin陰性患者中，間質細胞podoplanin陽性者37例。經Spearmann相關分析，兩者呈正相關(P<0.01，表3)。

表3 ESCC腫瘤細胞和間質細胞中podoplanin表達的相關性

3 討論

近年越來越多的研究表明，除了腫瘤細胞被作為治療干預的主要靶點外，腫瘤周圍的微環(huán)境以及腫瘤-間質細胞相互作用在腫瘤進展中也起著至關重要的作用[1]。podoplanin屬于Ⅰ型跨膜黏液樣糖蛋白，最初因發(fā)現其在小鼠腎小球足細胞表達而命名。隨后研究發(fā)現其可見于各種正常組織包括淋巴管內皮細胞、骨骼肌、胎盤等[2]。目前在外科病理診斷中主要是用于鑒別淋巴管和血管、診斷間皮瘤和睪丸生殖細胞腫瘤等標志物[3-4]。最近文獻報道podoplanin也可表達于各種惡性腫瘤細胞包括食管癌、頭頸部癌、乳腺癌以及癌相關性纖維母細胞中，其發(fā)揮不同的生物學意義[5-6]。

目前，podoplanin在食管癌中的表達已有一些文獻報道。Chuang等[7]報道59例ESCC中podoplanin的表達，結果發(fā)現ESCC中podoplanin高表達與淋巴結轉移相關，但未能發(fā)現與ESCC患者生存期低有關。Chao等[8]分析113例新輔助放、化療后ESCC中podoplanin的表達，結果發(fā)現腫瘤細胞podoplanin高表達與淋巴血管侵犯呈正相關，多因素分析顯示腫瘤細胞podoplanin表達是獨立的預后因素。Tong等[9]也發(fā)現腫瘤細胞中podoplanin高表達與ESCC淋巴結轉移密切相關，且podoplanin高表達ESCC患者的5年無瘤生存率明顯低于podoplanin中～低表達ESCC患者。上述結果顯示ESCC腫瘤細胞中podoplanin表達與淋巴結轉移、浸潤深度和TNM分期有關，提示腫瘤細胞podoplanin表達水平可預測ESCC的淋巴結轉移和進展，可促進ESCC的侵襲性生長。本實驗分析150例ESCC中podoplanin表達，結果顯示腫瘤細胞podoplanin表達與淋巴結轉移、脈管侵犯和pTNM分期呈正相關，也進一步證實腫瘤細胞中podoplanin表達可使ESCC癌細胞具有高度的侵襲、轉移能力。上皮-間質轉化是惡性腫瘤侵襲轉移的重要機制。Wicki等[10]研究發(fā)現podoplanin僅在腫瘤浸潤前沿與正常間質接觸的癌細胞中表達，且這些腫瘤細胞也同時呈E-cadherin細胞膜陽性，表明podoplanin并不是通過上皮-間質轉化促進腫瘤細胞遷移和浸潤周圍組織。Suzuki-Inoue等[11]研究發(fā)現podoplanin是表達于血小板表面的信號受體CLEC-2的內源性配體，當podoplanin與CLEC-2結合后能誘導血小板聚集，而血小板圍繞腫瘤細胞聚集可以保護腫瘤細胞免受剪切力和NK細胞的損害，促使血流內腫瘤細胞巢形成，同時活化的血小板也釋放生長因子，刺激血管形成或腫瘤生長。

雖然癌癥研究主要集中于腫瘤細胞，但最近研究顯示腫瘤間質對癌癥發(fā)生以及腫瘤細胞具有重要影響。腫瘤間質主要由癌相關性纖維母細胞組成，其基因和功能上不同于間質普通的纖維母細胞。梁曉東等[12]研究證實ESCC中podoplanin陽性間質細胞同時也表達α-SMA，提示癌相關性纖維母細胞具有肌纖維母細胞特征，結果顯示ESCC間質細胞中podoplanin表達與淋巴管侵犯有關，與患者性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移和臨床分期均無關。Hoshino等[13]應用體外實驗研究顯示，與人肺組織來源的纖維母細胞和肺腺癌細胞系共同注射相比，podoplanin陽性的人血管外膜纖維母細胞和肺腺癌細胞系共同注射可導致更高比例的腫瘤形成，進一步對112例肺腺癌標本中podoplanin表達進行分析，發(fā)現podoplanin陽性的癌相關性纖維母細胞有較高的淋巴結轉移率和復發(fā)風險。最近Hu等[6]對4 883例實體腫瘤進行Meta分析，結果顯示podoplanin陽性的癌相關性纖維母細胞明顯降低實體腫瘤類型的總生存期和無瘤生存期，且podoplanin陽性的癌相關性纖維母細胞數量越多，腫瘤越具有不良的臨床病理學特征如淋巴結轉移、TNM高分期、淋巴管和血管侵犯等。本實驗結果發(fā)現間質細胞中podoplanin表達隨著腫瘤浸潤深度增加而增加，伴淋巴結轉移和脈管侵犯的ESCC中間質細胞podoplanin表達明顯高于不伴有淋巴結轉移和脈管侵犯者；pTNM分期Ⅲ+Ⅳ期ESCC間質細胞中podoplanin表達明顯高于Ⅰ+Ⅱ期。本實驗結果進一步證實了ESCC中podoplanin陽性間質細胞可促進食管癌的發(fā)展。

目前podoplanin在食管癌中雖然已有一些研究，但其主要集中于腫瘤細胞或間質細胞中，且研究的病例數量較少。本實驗不僅分析podoplanin在腫瘤細胞或間質細胞中的表達，而且分析了其在腫瘤細胞和間質細胞中共表達的臨床病理學意義，國內外文獻尚未見相關報道。本實驗發(fā)現podoplanin在腫瘤細胞和間質細胞共陽性者44例，且腫瘤細胞和間質細胞中podoplanin共陽性與ESCC淋巴結轉移、脈管侵犯、神經侵犯和pTNM呈正相關，提示ESCC腫瘤細胞和間質細胞中podoplanin表達相互作用對食管癌的生物學行為具有明顯影響。本實驗相關分析顯示，腫瘤細胞podoplanin和間質細胞podoplanin表達呈正相關，進一步提示腫瘤細胞和間質癌相關性纖維母細胞之間的相互作用對腫瘤微環(huán)境具有明顯影響。有研究發(fā)現口腔鱗狀細胞癌中腫瘤細胞產生的IL-1β可刺激纖維母細胞分泌TGF-β1，后者可誘導口腔鱗狀細胞癌細胞的podoplanin表達，導致癌癥進展，同時鱗狀細胞癌細胞分泌的IL-1β也具有自分泌效應，可刺激鱗狀細胞癌細胞分泌TNFα，TNFα可以作為旁分泌信號促進癌相關性纖維母細胞活化，增強癌細胞的侵襲[14-15]。

總之，本組發(fā)現ESCC腫瘤細胞和間質細胞中podoplanin表達可以促進ESCC的侵襲性生長，且腫瘤細胞和間質細胞共表達podoplanin，提示腫瘤和間質可以協(xié)同作用增強ESCC的侵襲、轉移能力。因此，檢測ESCC中podoplanin表達可有助于評估ESCC的生物學行為，從而更好地指導臨床治療。