毛紅辰，張 幸，許海濤，李 峰，徐大勇，2①

（1. 淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北235000；2. 淮北師范大學(xué) 信息學(xué)院，安徽 淮北235000）

0 引言

白念珠菌（Candida albicans）是臨床上最常見(jiàn)的人體條件致病真菌，存在于健康人體的口腔、上呼吸道、消化道、生殖道等黏膜表面. 白念珠菌通常不會(huì)引起人體疾病，但是當(dāng)人體免疫系統(tǒng)受到損害或體內(nèi)正常微生物菌群失調(diào)時(shí)，該菌過(guò)度生長(zhǎng)引起淺部感染（如鵝口瘡、陰道炎等）；在免疫能力嚴(yán)重低下的人群中（如艾滋病患者、器官移植病人、經(jīng)過(guò)化療和理療的癌癥病人等），白念珠菌過(guò)度繁殖引起嚴(yán)重的系統(tǒng)性感染［1-2]. 據(jù)報(bào)道，在世界范圍內(nèi)，白念珠菌感染每年造成25萬(wàn)到40萬(wàn)患者死亡，以及大約1億次的復(fù)發(fā)性陰道炎的發(fā)病率［3-4]. 由于病人治療過(guò)程中大量使用抗真菌藥物，以及白念珠菌在病人人體組織和植入人體的導(dǎo)管等醫(yī)療器具表面形成生物膜，導(dǎo)致白念珠菌的耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重［5-8]. 因此，研究揭示白念珠菌的致病、耐藥機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新型抗真菌藥物的基因靶點(diǎn)，對(duì)預(yù)防和治療白念珠菌感染具有重要意義.

白念珠菌SC5314基因組測(cè)序的完成［9]，為其基因功能的研究提供了極大的便利. 通過(guò)基因敲除并測(cè)試基因缺失株的表型是研究基因功能最常用的方法之一，由于白念珠菌一般情況下是二倍體細(xì)胞，基因敲除有一定的難度. 目前白念珠菌的基因敲除技術(shù)一般是基于營(yíng)養(yǎng)缺陷型或抗藥性標(biāo)記. 例如：URA3-blaster（尿苷合成基因標(biāo)記）［10]、SAT1-flipper（諾爾斯菌素抗性基因標(biāo)記）［11]、從非白念珠菌PCR 擴(kuò)增HIS1/LEU2/ARG4營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記敲除盒等［12]. 但是單一使用一種基因標(biāo)記敲除方法存在敲除效率低的問(wèn)題.真核生物細(xì)胞中，cAMP信號(hào)通路調(diào)控多種細(xì)胞過(guò)程，其過(guò)程是胞外信號(hào)與細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP 的水平變化而引起細(xì)胞各種反應(yīng)［13]. 環(huán)核苷酸磷酸二酯酶（Cyclic nucleo?tide phosphodiesterase，PDE）是催化細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸水解的一類磷酸酯酶，對(duì)細(xì)胞內(nèi)cAMP/AMP 或者cGMP/GMP水平進(jìn)行控制，從而調(diào)控的細(xì)胞生理代謝反應(yīng)［14]. 在釀酒酵母中，ScPDE2編碼對(duì)cAMP具有高親和力的環(huán)核苷酸磷酸二酯酶2（ScPde2），其在控制細(xì)胞內(nèi)cAMP/AMP濃度及調(diào)節(jié)多個(gè)生理過(guò)程起到重要作用［15]. 本研究以人體條件致病真菌白念珠菌CaPDE2為例，綜合應(yīng)用尿苷合成基因標(biāo)記（URA3）和諾爾斯菌素抗性基因標(biāo)記（SAT1）高效敲除CaPDE2基因，并測(cè)試CaPDE2基因缺失株的表型，對(duì)CaPDE2基因在白念珠菌細(xì)胞中的功能進(jìn)行探究.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物：本研究使用的菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1，引物見(jiàn)表2.

表1 本研究使用的菌株和質(zhì)粒

表2 本研究使用的引物

1.1.2 主要藥品及試劑

限制性內(nèi)切酶、DNA 聚合酶、氨芐青霉素鈉等購(gòu)自寶生物工程有限公司；Ezmax One-Step 克隆試劑盒購(gòu)自吐露港生物科技有限公司；諾爾斯菌素（ClonNAT）購(gòu)自Jena Bioscience 公司；所有引物及5-氟乳清酸（5-FOA）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；鮭魚(yú)精DNA、醋酸鋰、聚乙二醇3350、酮康唑、氟康唑等購(gòu)自Sigma公司.

1.1.3 培養(yǎng)基

LB+Amp培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L，酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，pH 7.0，滅菌后加氨芐青霉素鈉濃度至100 μg/mL；YPD培養(yǎng)基：酵母浸出粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L；YPD+200 μg/mL ClonNAT培養(yǎng)基：YPD 培養(yǎng)基滅菌后添加終濃度為200 μg/mL 的ClonNAT；YPD+25 μg/mL ClonNAT 培養(yǎng)基：YPD 培養(yǎng)基滅菌后添加終濃度為25 μg/mL的ClonNAT；YPD+0.1% 5-FOA培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基滅菌后添加終濃度為0.1%的5-氟乳清酸（5-FOA）. SD-URA 培養(yǎng)基：無(wú)氨基酸酵母氮源6.7 g/L，省卻尿苷酸氨基酸混合物粉末0.71 g/L，葡萄糖20；SD-URA+200 μg/mL ClonNAT 培養(yǎng)基：SD-URA培養(yǎng)基滅菌后添加終濃度為200 μg/mL的ClonNAT.

1.2 方法

1.2.1 CaPDE2基因的SAT1-flipper敲除盒的構(gòu)建

以質(zhì)粒pSFS2為模板，用引物PDE2-F、PDE2-R，以白念珠菌SC5314基因組作為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增敲除CaPDE2的SAT1-flipper敲除盒.

1.2.2 CaPDE2基因的URA3-blaster敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

用引物PDE2-L-UP、PDE2-L-DOWN，以白念珠菌SC5314 基因組作為模板，通過(guò)PCR 擴(kuò)增出CaP?DE2 開(kāi)放閱讀框上游序列965 bp 作為基因敲除上游同源臂，通過(guò)無(wú)縫克隆試劑盒克隆到質(zhì)粒p5921 的SacI和KpnI位點(diǎn)；然后，用引物PDE2-R-UP、PDE2-R-DOWN，以白念珠菌SC5314基因組作為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出CaPDE2開(kāi)放閱讀框下游序列713 bp作為基因敲除下游同源臂，克隆到質(zhì)粒p5921的BamHI和HindⅢ位點(diǎn)；至此獲得CaPDE2基因的URA3-blaster 敲除質(zhì)粒，然后用SacI和HindⅢ雙酶切此敲除質(zhì)粒，即獲得CaPDE2基因的URA3-blaster敲除盒.

1.2.3 CaPDE2雙等位基因的敲除

用方法1.2.1 獲得的CaPDE2 基因的SAT1-flipper 敲除盒，采用醋酸鋰方法［11]轉(zhuǎn)化到野生型菌株CAI4，在YPD+200 μg/mL ClonNAT平板上篩選獲得敲除CaPDE2第一等位基因的菌株；用方法1.2.2獲得的CaPDE2基因的URA3-blaster敲除盒，采用醋酸鋰方法轉(zhuǎn)化到敲除CaPDE2第一等位基因的菌株中，在SD-URA+200 μg/mL ClonNAT 平板上篩選獲得敲除CaPDE2第二等位基因的菌株. 將敲除CaPDE2雙等位基因的菌株依次培養(yǎng)在YPD+25 μg/mL ClonNAT、YPD+0.1% 5-FOA平板上，以去除諾爾斯菌素抗性基因標(biāo)記SAT1和尿苷合成基因標(biāo)記URA3.

1.2.4 CaPDE2缺失株的表型試驗(yàn)

挑取CAI4、CaPDE2缺失株菌株的單菌落接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，之后將CAI4、CaPDE2缺失株菌株的細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)成5×107個(gè)細(xì)胞/mL. 按照文獻(xiàn)［16-17]表型試驗(yàn)操作方法將菌液被稀釋至10-4. 然后從每個(gè)離心管中吸取2 μL稀釋菌液點(diǎn)接至YPD及含有相應(yīng)藥物的YPD培養(yǎng)基上. 30 ℃倒置培養(yǎng)，拍照觀察.

2 結(jié)果與分析

2.1 CaPDE2基因的URA3-blaster敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

以野生型菌株CAI4 基因組DNA 為模板，PDE2-L-UP、PDE2-L-DOWN為引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增出CaPDE2 開(kāi)放閱讀框上游的同源片段965 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接到用SacI、KpnI處理的p5921 載體中，獲得質(zhì)粒pDY1. 接下來(lái)，以白念珠菌SC5314 基因組DNA 為模板，PDE2-R-UP、PDE2-R-DOWN 為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出CaPDE2 開(kāi)放閱讀框下游的同源片段713 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接到用Bam?HI、HindⅢ處理的pXD1載體中，獲得CaPDE2基因的URA3-blaster敲除質(zhì)粒pDY2，如圖1所示. 將pDY2用SacI、HindⅢ雙酶切，獲得CaPDE2基因的URA3-blaster敲除盒（5.7 kb），如圖2所示.

圖1 CaPDE2基因的URA3-blaster敲除質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖

圖2 CaPDE2基因的URA3-blaster敲除質(zhì)粒pDY2的SacI、HindⅢ雙酶切驗(yàn)證

2.2 聯(lián)合應(yīng)用尿苷合成基因標(biāo)記URA3和諾爾斯菌素抗性基因標(biāo)記SAT1敲除CaPDE2雙等位基因

白念珠菌是二倍體，對(duì)白念珠菌基因的敲除必須敲除目的基因的兩個(gè)等位基因. 本研究出發(fā)菌株CAI4是尿苷營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株［10]，而且對(duì)諾爾斯菌素敏感［11]. 白念珠菌CaPDE2編碼的磷酸二酯酶2蛋白，是Ras/cAMP/PKA 通路中的重要成員，該酶催化cAMP 水解成5′-AMP 而降低胞內(nèi)cAMP 濃度，以維持胞內(nèi)適當(dāng)?shù)腸AMP濃度. 應(yīng)用諾爾斯菌素抗性基因標(biāo)記SAT1敲除CaPDE2第一等位基因. 以質(zhì)粒pSFS2為模板，用引物PDE2-F、PDE2-R，以CAI4 基因組作為模板，PCR 擴(kuò)增出大小約為4.3 kb 的CaPDE2 的SAT1-flipper 敲除盒（圖3）. 將該敲除盒轉(zhuǎn)化至CAI4 中，涂布于200 μg×mL-1ClonNAT 的YPD 平板，30 ℃培養(yǎng)48 h，挑取ClonNAT 抗性菌株純化，獲得敲除CaPDE2 第一等位基因的菌株，其基因型是Cap?de2：：SAT1-flipper/CaPDE2. 接下來(lái)，將構(gòu)建好的含有CaPDE2 的URA3-blaster 敲除盒的質(zhì)粒pDY2，用SacI和HindⅢ雙酶切，獲得5.7 kb帶有URA3篩選標(biāo)記的CaPDE2敲除盒（圖2）. 將此敲除盒轉(zhuǎn)化至菌株Capde2：：SAT1-flipper/CaPDE2中，涂布在SD-URA+200 μg/mL ClonNAT平板上，30 ℃培養(yǎng)48～72 h，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并驗(yàn)證，獲得敲除CaPDE2第二等位基因菌株. 之后用YPD+25 μg/mL ClonNAT平板擠掉SAT1 抗性基因，進(jìn)一步用YPD+0.1% 5-FOA 平板去除URA3 基因，最終獲得CaPDE2 基因缺失株DY?CA1，其基因型為Capde2：：FRT/Capde2：：hisG（圖4，5）. 如圖5 所示，用引物PDE2-UP-CHECK/DOWCHECK：以CAI4基因組為模板，擴(kuò)增出2.2 kb的片段（包含CaPDE2基因全長(zhǎng)ORF序列及其一部分啟動(dòng)子和終止子序列）；以CaPDE2 基因缺失株的基因組為模板，擴(kuò)增出0.85 kb 和1.7 kb（包含hisG 序列及CaPDE2基因的一部分啟動(dòng)子和終止子序列）的2個(gè)片段. 用引物PDE2-ORF-UP/DOWN：以CAI4基因組為模板，擴(kuò)增出0.55 kb的片段（CaPDE2基因ORF的一部分序列）；以CaPDE2缺失株的基因組為模板，未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，表明CaPDE2的2個(gè)等位基因都已被敲除.

圖3 PCR擴(kuò)增CaPDE2的諾爾斯菌素抗性SAT1-flipper敲除盒

圖4 聯(lián)合應(yīng)用尿苷合成基因標(biāo)記URA3和諾爾斯菌素 抗性基因標(biāo)記SAT1敲除CaPDE2雙等位基因示意圖

2.3 CaPDE2基因缺失株對(duì)氟康唑、酮康唑、SDS及42 ℃的敏感

圖5 CaPDE2基因缺失株的PCR驗(yàn)證

圖6 白念珠菌CaPDE2基因缺失株對(duì)氟康唑、酮康唑、SDS及42 ℃的敏感性

通過(guò)倍比稀釋表型試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)（圖6），與野生型菌株CAI4 相比，CaPDE2 基因缺失株對(duì)4 μg/mL KCZ（Ketoconazole，酮康唑）、5 μg/mL FLU（Fluconazole，酮康唑）、細(xì)胞膜干擾劑0.04% SDS（Sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸鈉）以及42 ℃均敏感，表明白念珠菌CaPDE2基因在耐受抗真菌藥物、細(xì)胞膜壓力及高溫脅迫方面起作用.

3 結(jié)論與討論

在本研究中，聯(lián)合采用URA3 和SAT1 篩選標(biāo)記完成了CaPDE2 雙等位基因的敲除，并獲得了去掉SAT1和URA3基因標(biāo)記的CaPDE2基因缺失株，其基因型為Capde2：：FRT/Capde2：：hisG. 白念珠菌基因敲除的難度在于目的基因第二等位基因的敲除，本研究聯(lián)合應(yīng)用URA3和SAT1篩選標(biāo)記進(jìn)行基因敲除的優(yōu)勢(shì)：一是可以高效敲除目的基因的第二等位基因；二是去掉SAT1和URA3基因標(biāo)記的缺失株可以用于構(gòu)建多個(gè)基因的缺失株，研究多個(gè)基因（2個(gè)以上基因）的缺失對(duì)于白念珠菌的影響或用于研究多個(gè)基因之間的相互關(guān)系.

表型試驗(yàn)結(jié)果表明，CaPDE2基因缺失株對(duì)細(xì)胞膜干擾劑SDS敏感，與Jung等［18]報(bào)道的結(jié)果一致，表明敲除CaPDE2 基因很可能導(dǎo)致白念珠菌的細(xì)胞膜組分發(fā)生變化，從而導(dǎo)致CaPDE2 基因缺失株對(duì)SDS敏感. 研究還發(fā)現(xiàn)，CaPDE2基因缺失株對(duì)抗真菌藥物氟康唑和酮康唑敏感，表明CaPDE2基因在耐受唑類抗真菌藥物起作用. 唑類藥物是目前臨床常用的抗真菌藥物，唑類藥物發(fā)揮抗真菌作用是通過(guò)干擾羊毛甾醇14-α-去甲基化酶活性使得麥角甾醇的合成受阻，導(dǎo)致有毒的甾醇14-α-methyl-3，6-diol 的積累，該有毒甾醇的積累會(huì)使真菌細(xì)胞膜形成嚴(yán)重的壓力，從而起到抗真菌作用［19]. 但是由于目前唑類抗真菌藥物的大量使用，使得白念珠菌對(duì)唑類藥物產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性［20]. 白念珠菌缺失CaPDE2基因?qū)е录?xì)胞對(duì)唑類藥物敏感，因此，CaPDE2可以作為開(kāi)發(fā)新的抗真菌藥物的潛在靶點(diǎn). 本研究還表明，CaP?DE2基因缺失株對(duì)42 ℃敏感，其具體耐熱機(jī)制有待進(jìn)一步研究.