楊學(xué)琴 毛鑫玉 陳鈺婷 李悅蘭 張 文

1（深圳市職業(yè)病防治院病理毒理所 深圳518020）

2（河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院衛(wèi)生檢驗與檢疫專業(yè) 張家口075000）

隨著人類基因組計劃的推進，研究環(huán)境對人類健康影響的環(huán)境毒理學(xué)進入了毒理基因組學(xué)時代，從傳統(tǒng)的遺傳毒性檢測方法轉(zhuǎn)變?yōu)榛蚣簷z測方法，同時提高遺傳損傷效應(yīng)的檢測能力并降低檢測閾值［1］。電離輻射是環(huán)境物理因素對人類健康影響的研究熱點，對生物體的影響最為突出的分子機制表現(xiàn)為遺傳物質(zhì)的損傷。目前較為成熟的輻射遺傳損傷檢測主要有染色體畸變率分析和淋巴細胞微核分析。染色體畸變率分析是目前公認準確性高、較為可靠的“金標準”，實際應(yīng)用中存在培養(yǎng)時間長，對鏡檢人員技術(shù)要求較高，耗時耗力等不足之處［2-3］。淋巴細胞微核分析的敏感性、特異性、準確性與染色體畸變率分析的結(jié)果幾乎相當，是染色體損傷快速初篩的試驗方法，但也需要對細胞進行培養(yǎng)，并且微核率易受年齡，生活方式和環(huán)境的影響，導(dǎo)致本底值升高［4］。隨著毒理基因組學(xué)的不斷發(fā)展，利用輻射敏感基因的集群檢測方法估算電離輻射對人類健康的影響將會有效提高檢測效率和敏感性。

利用生物學(xué)指標確定已接受照射劑量的測定體系稱為生物劑量計，一個好的生物劑量計應(yīng)具備以下幾點［5］：對電離輻射有特異性或至少在正常人自發(fā)本底值較低；具有較高的靈敏度，且與照射劑量相關(guān)性較好；為整體與離體效應(yīng)一致；對大劑量急性照射和對小劑量累積照射均有較好的劑量–效應(yīng)關(guān)系；個體間變異小；方法簡便，取材方便；測定方法快速，有可能借助儀器實現(xiàn)自動化。

傳統(tǒng)的染色體畸變率分析和淋巴細胞微核分析兩種方法對早期、快速、高效估算疑似受照人員劑量存在著方法本身的缺陷。本研究將從健康人群輻射敏感基因本底水平，健康人群與輻射接觸人群輻射敏感基因表達量的差異性，以及輻射敏感基因的劑量–效應(yīng)關(guān)系3個方面進行探索。選擇 磷 脂 酰 肌 醇 聚 糖 -A 基 因（Phosphatidylinositolglycan-class A， Pig-a）、生長阻滯和DNA 損傷誘導(dǎo)基因45（Growth arrest and DNA damage inducible 45， Gadd45α）及次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因（Hypoxanthine phosphoribosyltransferase， Hprt）3 個基因，以人體外周血為材料，利用實時熒光定量PCR檢測這3個基因的表達水平，對其是否能作為輻射損傷生物劑量計進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 外周血的采集與照射

選擇非放射從業(yè)健康人群（對照組）和放射從業(yè)人員（暴露組）各25名，收集其體檢血液2 mL，肝素鈉抗凝。研究對象符合中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會制定的《涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究倫理審查辦法（試行）》（2007）的要求，并通過深圳市職業(yè)病防治院倫理審查委員會討論批準。嚴格按照批準的研究方案開展研究工作。

采集三名健康成年人（均無吸煙史與飲酒史，近期未接受X射線檢查等放射影響）外周血各25 mL，肝素鈉抗凝。將每份抗凝血平均分為5份，每份5 mL。照射條件：采用6 MV X射線機（Elekta Synergy，Linacd House， Fleming Way， Cawley， West Sussex PH10 2RR，UK），照射劑量率300 cGy/min，源靶距100 cm，照射野8.0 cm×8.0 cm。設(shè)置劑量為0Gy、0.10Gy、0.25Gy、0.50Gy、1.00Gy、2.00 Gy和5.00 Gy。 國際協(xié)調(diào)委員會（International Conference on Harmonization，ICH）頒布的指導(dǎo)原則S2（R1）受照細胞相對存活率不低于（55±5）%，每個劑量點至少重復(fù)3次［6］。將照射后的血樣置于37 ℃的培養(yǎng)箱中放置6 h后進行mRNA的提取。

1.1.2 主要試劑和儀器

Red Cell Lysis Buffer（RT122-02）、FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（KR118）、FastFire qPCR PreMix （SYBR Green）快速熒光定量PCR預(yù)混試劑盒（FP207-01）（北京TIANGEN 公司）；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 血 液 總 RNA 提 取 試 劑 盒（11828665001）（瑞士Roche 公司）；Optical 8-Cap Strips for 0.2 mL tube strips/plates（TCS0803）（美國Bio-Rad 公司）；Agarose， LMP， Preparative Grade for Large Fragments （＞1 000 bp）（V2831）（美國Promega 公司），Real Time PCR 儀（CFXConnect Bio-Rad 美國）。

1.1.3 基因引物

使用Olige 6 設(shè)計合成的引物序列見表1。正、反向引物序列為5′-3′。

表1 輻射敏感基因和內(nèi)參基因引物序列Table 1 Primer sequence of radiosensitive gene and internal reference gene

1.2 方法

1.2.1 全血總RNA 的提取

將采集外周血500 μL 加入1.5 mL RNase-free EP管中，然后加入1 mL紅細胞裂解液，倒置混勻10 min，使血樣充分裂解，4 000 r/min 離心3 min，棄去上清液，加入200 μL PBS 緩沖液重懸。加入400 μL Lysis-/Binding Buffer，渦旋15 s。將樣品沿管壁緩慢移至組合好的反應(yīng)管上層，8 000 r/min離心15 s。棄去收集管廢液后重新組合過濾籃，每管加入混勻的90 μL DNase Incubaton Buffer、10 μL Dnase I，孵育15 min。加入500 μL Wash Buffer I，8 000 r/min 離心15 s。棄廢液后重新組合過濾籃，加入500 μL Wash Buffer Ⅱ，8 000 r/min 離心15 s。棄廢液后重新組合過濾籃，加入200 μL Wash Buffer Ⅱ，11 000 r/min 離心2 min。棄去收集管，將過濾籃插入1.5 mL RNase-free EP管中，加入75 μL Elution Buffer，13 000 r/min 離心1 min。將收集到的總RNA放入-20°C保存。

1.2.2 總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA

將-20 °C 保存的總RNA 取出，于冰上解凍。在冰上按照如下反應(yīng)體系配制所需反應(yīng)液的混合液：4 μL 的5×FastKing-RT SuperMix 和16 μL 的Total RNA；反應(yīng)條件：42°C，15 min；95°C，3 min。將所得cDNA放入-20°C保存。

1.2.3 利用RT-PCR檢測基因表達

將-20°C保存的cDNA取出，于冰上解凍。為了保證體系反應(yīng)液配制的準確性，應(yīng)按照多于1個反應(yīng)數(shù)的進行試劑配制，然后分裝到各個反應(yīng)管中，最后加入cDNA 樣品。反應(yīng)體系20 μL，設(shè)置3個檢測復(fù)孔。在冰上按照如下反應(yīng)體系配制所需反 應(yīng) 液 的 混 合 液：10 μL 的2×FastFire qPCR PreMix，正向引物（5 μmol/L）、反向引物（5 μmol/L）各1.2 μL，5 μL 的cDNA 模板，2.6 μL RNase-Free ddH2O，共20 μL 反應(yīng)體系；反應(yīng)條件：95 ℃1 min后進行40 個95 ℃5 s、55 ℃10 s、72 ℃15 s 的循環(huán)。用紫外分光光度計檢測DNA 濃度和純度（激發(fā)波長分別為260 nm 和280 nm 時吸光度的比值，A260/A280值）。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0 軟件進行分析。輻射敏感基因本底水平統(tǒng)計分析采用平均值、波動范圍（25%～75%）和變異系數(shù)（標準偏差/平均數(shù)）描述本底水平在人群中差異程度。健康人群與輻射接觸人群敏感基因表達量差異性分析采用ΔCT（Threshold cycle，CT）方法，以看家基因Gapdh為內(nèi)參，配對t檢驗分析兩組統(tǒng)計學(xué)差異。輻射敏感基因劑量–效應(yīng)研究利用2-△△CT法，計算各個敏感基因相對于內(nèi)參基因的表達水平，ΔCT=CT，目的基因-CT，內(nèi)參基因，ΔΔCT=ΔCT，照射組樣品-ΔCT，對照組樣品。RT-PCR檢測結(jié)果數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，二項式曲線回歸分析，p＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Graphpad 5.0軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 人群樣本基本信息

對照組和暴露組均為25 人。暴露組平均年齡為36.12歲，其中男性為19人，女性為6人，平均暴露時間為111.52 d；對照組平均年齡為23.76歲，其中男性為18 人，女性為7人，平均暴露時間為0 d。對照組和暴露組匹配。

2.2 SYBR Green 熒光定量RT-PCR 擴增特異性驗證

熔解曲線分析顯示Gapdh、Gadd45α、Hprt、Pig-a 基因均為單峰，并且Pig-a 基因PCR 擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳也顯示為單一條帶，表明PCR擴增均為特異性的擴增，見圖1。

圖1 Gapdh(a)、Gadd45α(b)、Hprt(c)與Pig-a(d)基因熔解曲線分析Fig.1 Analysis of Gapdh(a),Gadd45α(b),Hprt(c),and Pig-a(d)melting curves

2.3 輻射敏感基因本底水平統(tǒng)計分析

采集25 名非放射從業(yè)健康人員的外周血進行輻射敏感基因本底水平分析。Pig-a 基因相對表達量的平均值為2.990，波動范圍是2.595～3.882，變異系數(shù)18.73%；Gadd45α 基因相對表達量的平均值為6.470，波動范圍是2.693～8.627，變異系數(shù)19.62%；Hprt 基因相對表達量的平均值為6.470，波動范圍是4.894～8.627，變異系數(shù)24.49%。Piga、Gadd45α 基因的變異系數(shù)均在20%以內(nèi)，表明Pig-a、Gadd45α 基因在健康人群中本底水平差異較小，表達水平相對均一。Hprt 基因變異系數(shù)大于20%，表明在健康人群中本底水平差異較大，應(yīng)考慮剔除。

2.4 暴露組和對照組敏感基因相對表達量的比較

Gadd45α、Hprt、Pig-a 基因相對表達量見圖2。對照組與暴露組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。Hprt基因在對照組中的相對表達量高于暴露組（t=2.105，p=0.046）；Gadd45α基因在對照組中相對表達量低于暴露組（t=4.762，p＜0.01）；Pig-a基因在對照組的相對表達量低于暴露組（t=2.441，p=0.022）。

圖2 對照組與暴露組中Gadd45α(a)、Hprt(b)與Pig-a(c)基因相對表達量（***p＜0.01，**p＜0.02，*p＜0.05，與對照組相比）Fig.2 Gene expression of Gadd45α(a)、Hprt(b)、Pig-a(c)in control and exposed groups(***p＜0.01,**p＜0.02,and*p＜0.05 compared with the control group)

2.5 X射線照射后Gadd45α、Hprt、Pig-a基因表達的劑量-效應(yīng)關(guān)系

如圖3 所示，X 射線照射6 h 后，人外周血淋巴細胞Gadd45α 基因表達隨著照射劑量的增加而上升，劑量和基因相對表達量擬合的二項式曲線為y=0.130 7x2+0.487 8x+1.251 8，相關(guān)系數(shù)為R2=0.989 7，曲線顯示在0.5 Gy時，Gadd45α基因表達上升幅度較大；Hprt 基因相對表達量在0～2 Gy 范圍內(nèi)隨著劑量的增加而上升，擬合曲線為y=0.577 2x2?0.175 4x+1.014 7，R2=0.975 1，在5 Gy 劑量點表達量下降；Pig-a 基因表達隨著照射劑量的增加而上升，y=0.363 5x2+0.176 4x+1.383 2，R2=0.995 8。經(jīng)SPSS 19.0 回歸分析檢驗，存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。

圖3 輻射敏感基因Gadd45α(a)、Hprt(b)與Pig-a(c)劑量?效應(yīng)曲線擬合Fig.3 Dose?effect curves for radiation sensitive genes Gadd45α(a),Hprt(b),and Pig-a(c)

3 討論

核安全及輻射防護一直是環(huán)境保護與公共衛(wèi)生關(guān)注重點的領(lǐng)域之一。核事故發(fā)生后的早期，對疑似受照人員進行受照劑量快速估算和分類診斷以及及時救治具有十分重要的意義。利用輻射敏感基因表達變化作為輻射損傷標志物用于生物劑量估算的研究早已有報道［7-9］。將特定的基因圖譜改變與特定劑量或時間的毒性損傷表現(xiàn)相關(guān)聯(lián)［10］。這些輻射敏感基因涉及DNA修復(fù)、細胞周期調(diào)控、細胞凋亡、細胞骨架組裝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)基因，并不局限于染色體損傷相關(guān)基因。這些敏感基因的改變包括表達量的變化和基因本身突變兩種。

Pig-a 基因位于人類X 染色體短臂Xp22.1，可編碼N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物，參與糖基磷脂酰肌醇（GlycosyIphosphatidyl jnositol，GPI）連接蛋白的早期合成［11］。近年來Pig-a基因多用于Pig-a 突變試驗，這是一種反映體內(nèi)基因突變遺傳學(xué)終點的致突變試驗。Pig-a 基因的表達具有普遍性，目前多采用流式細胞儀檢測外周血紅細胞及淋巴細胞系的Pig-a 基因突變［12-13］。但實時熒光定量PCR 不僅方法操作簡單，并且能快速明了地對結(jié)果進行分析，本次研究RT-qPCR的結(jié)果顯示Piga基因表達量隨著吸收劑量的增大而增加，具有一定的輻射敏感性，Pig-a 基因在健康人群的表達相對均一，波動范圍較小，個體間變異?。惠椛浣佑|人群Pig-a基因的表達量高于健康人群，顯示出小劑量長期照射對Pig-a基因表達的影響是刺激基因的表達；經(jīng)X 射線照射后，發(fā)現(xiàn)Pig-a 基因的表達量隨著照射劑量的增加而上升，具有很好的劑量?效應(yīng)關(guān)系。Pig-a基因在輻射接觸人群中表現(xiàn)出的表達量增加和X 射線急性照射后表達量變化趨勢相同，大劑量急性照射和小劑量累積照射均刺激Pig-a基因的表達。以上結(jié)果均顯示出Pig-a基因相對表達量的變化有可能作為生物劑量計，具有好的生物劑量的特點，相較于傳統(tǒng)的染色體畸變率分析和淋巴細胞微核分析，Pig-a 基因相對表達量檢測時間大大縮短，從采樣到RNA提取再到RTqPCR只需花費約2 h。

Gadd45α 基因是生長抑制DNA 損傷基因45 家族成員之一，為生長阻滯和DNA 損傷基因。該基因可被多種電離輻射誘導(dǎo)，以p53依賴和非依賴的方式表達增強，參與了細胞的生長抑制和DNA 的損傷誘導(dǎo)，在輻射誘導(dǎo)的細胞凋亡、細胞周期阻滯及DNA修復(fù)中起重要作用［14］。使用Cs γ射線照射大鼠外周血，Gadd45α基因表達量與照射劑量有關(guān)，基因表達量隨照射劑量的增加具有一定的上升趨勢［15］。潘艷等［16］在實驗中使用實時熒光定量PCR檢測60Co γ射線照射后正常人外周血永生化淋巴細胞系，結(jié)果表明：Gadd45 基因的表達水平隨照射劑量的增高而增加。本次研究中驗證了Gadd45α基因的輻射敏感性，Gadd45α基因在健康人群中的表達量相對均一，波動范圍較小，個體間變異?。惠椛浣佑|人群的Gadd45α 基因表達量高于健康人群，具有較高的靈敏度，同時顯示小劑量長期照射對Gadd45α 基因的表達影響是刺激基因的表達；經(jīng)X射線照射后，Gadd45α基因的表達量隨照射劑量的增加而上升，具有良好的劑量?效應(yīng)關(guān)系，與小劑量長期照射后Gadd45α 基因的表達趨勢相同。以上結(jié)果均顯示出Gadd45α 基因相對表達量的變化可能作為生物劑量計。

Hprt基因位于X染色體長臂遠端q26.27，功能上是半合子，突變時可表現(xiàn)出來，由這個基因編碼的蛋白質(zhì)是一個轉(zhuǎn)移酶。該基因?qū)﹄婋x輻射以及化學(xué)誘變劑非常敏感，并且這種突變不可逆［17］。使用不同劑量的60Co γ 射線照射人肺泡細胞后，Hprt基因突變變異子數(shù)隨劑量的增加而逐漸增加，回歸方程表明兩者呈良好的線性直線關(guān)系［18］。崔鳳梅等［19］的實驗結(jié)果中表明Hprt基因突變頻率與照射劑量的關(guān)系呈線性模型，隨照射劑量的增大，基因突變頻率上升。在本次研究中表明Hprt 基因的輻射敏感性，Hprt 基因在健康人群中的表達量個體間變異較大；輻射接觸人群的Hprt 基因表達量低于健康人群，具有較高的靈敏度，同時顯示小劑量長期照射對Gadd45α 基因的表達影響是抑制基因的表達；經(jīng)X 射線照射后，發(fā)現(xiàn)Hprt 基因的表達量在0～2 Gy 隨照射劑量的增加而上升，具有良好的劑量?效應(yīng)關(guān)系，但在5 Gy劑量點表達量下降，偏離劑量?效應(yīng)曲線，與小劑量長期照射后Hprt 基因的表達趨勢不同。以上結(jié)果顯示出Hprt基因相對表達量的變化是否能作為生物劑量計體系有待進一步研究。

Pig-a基因與Gadd45α基因均具有本底值較低，差異較小，個體間變異小，對電離輻射有較高的靈敏度，基因表達量與照射劑量在大劑量與小劑量照射累積均具有良好的劑量?效應(yīng)關(guān)系等優(yōu)點，說明Pig-a 基因與Gadd45α 基因有發(fā)展為良好的生

物劑量計的潛質(zhì)。但Gadd45α 基因表達量在小劑量范圍內(nèi)存在波動，人群本底值大于Pig-a 基因，波動范圍較Pig-a基因大，所以Pig-a基因可能更具有作為良好生物劑量計的潛質(zhì)。本研究目前樣本量偏少，結(jié)果可能存在一些不確定性，下一步對Piga基因表達和輻射之間的關(guān)系做進一步研究時，將擴大樣本量，并增加照射后的采樣時間點。而Hprt 基因本底值雖然較低但個體間變異較大，并且在5 Gy 劑量點偏離0～2 Gy 的劑量?效應(yīng)曲線，故其是否能成為一個生物劑量計還有待研究。