李星宇，劉 港，高逸飛，郭慶中，吳江渝，鄭華明

武漢工程大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430205

花青素（anthocyanin，Cy）又名花色素，是一種水溶性天然色素，廣泛存在于自然界的各種植物中［1］。目前已知的Cy 有20 多種，如矢車菊素、飛燕草素、牽牛Cy 等。Cy 具有非常強(qiáng)的抗氧化清除自由基的能力，并且作為一種食品添加劑，不僅沒有傳統(tǒng)食品添加劑的副作用，而且還能軟化血管，降低血糖，具有一定的保健功能［2］。但是，Cy 在具有抗氧化性的同時(shí)，自身難免易于被空氣中的氧氣氧化導(dǎo)致活性降低，為了能夠提高Cy 的穩(wěn)定性，利用微膠囊技術(shù)對(duì)Cy 進(jìn)行包封是一種很好的途徑。

多糖、蛋白質(zhì)作為天然高分子材料，無毒、易降解，已成為制備微膠囊最廣泛使用的壁材［3］。Rutz 等［4］以殼聚糖和果膠為壁材，采用復(fù)凝聚法制備了棕櫚油微膠囊，在酸乳的生產(chǎn)上得到了很好的應(yīng)用。Yuan 等［5］以大豆分離蛋白和殼聚糖為原料制備了包封海藻油的微膠囊，發(fā)現(xiàn)殼聚糖有助于提高海藻油的包封率和抗氧化穩(wěn)定性。Svanberg 等［6］以乳清分離蛋白為乳化劑，在越桔油的乳液中加入Cy，發(fā)現(xiàn)Cy 對(duì)脂肪的氧化具有極強(qiáng)的保護(hù)作用。

本文采用天然高分子材料海藻酸鈉和殼聚糖對(duì)Cy 進(jìn)行包封，控制氯化鈣、海藻酸鈉、殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，制備了海藻酸鈉-殼聚糖載花青素微膠囊（anthocyanin-loaded microcapsules，CyMCs），分析了CyMCs 的包封率、抗氧化性及形貌特性等。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

海藻酸鈉（Medium viscosity）、殼聚糖（low viscosity）（sigma-aldrich 公司）；Cy（純度為25%，以矢車菊-3-葡萄糖苷計(jì)），自提?。淮罂讟渲ˋB-8，北京索萊寶科技有限公司）；其它用于實(shí)驗(yàn)的試劑（分析純，國藥集團(tuán)試劑有限公司）。

紫外分光光度計(jì)（Lambda35，Perkin Elmer），冷凍干燥機(jī)（Alpha1-4Dplus，Christ 公司），恒流泵（BT-100-4，上海青浦滬西儀器廠），傅里葉變換紅外光譜儀（L1600301，Perkin Elmer）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微膠囊的制備 取一定量的海藻酸鈉和殼聚糖分別加入到去離子水和醋酸水溶液（體積分?jǐn)?shù)1.0%）中，室溫條件下，600 r/min 磁力攪拌2 h，得到透明黏稠狀溶液，于4 ℃冰箱儲(chǔ)存24 h，備用。將一定量的氯化鈣加入殼聚糖的醋酸溶液中，攪拌使氯化鈣完全溶解。將海藻酸鈉溶液經(jīng)恒流泵通過25G（內(nèi)徑為0.26 mm）的針頭，維持針頭與液面距離為10 cm，逐滴滴入到殼聚糖/氯化鈣溶液中，磁力攪拌（400 r/min）反應(yīng)30 min，使微膠囊固化成型。布氏漏斗過濾后，冷凍干燥，得到海藻酸鈉-殼聚糖空白微膠囊（blank microcapsules，BMCs）；取一定量的Cy 溶于海藻酸鈉溶液中，攪拌使其分散均勻，制備過程與BMCs 相同，得到海藻酸鈉-殼聚糖CyMCs。

1.2.2 材料表征 將樣品在105 ℃真空干燥箱中干燥24 h，用溴化鉀壓片進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）分析。

1.2.3 CyMCs 包封率的測定 采用間接測量法［7］，測量未包封的Cy 含量來計(jì)算微膠囊的包封率。取制備CyMCs 時(shí)的濾液，將其pH 值分別調(diào)節(jié)至1.0和4.5，在λmax=524 nm 和λ=700 nm 時(shí)測吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程y=0.014 6x+0.008 9（x 為Cy 的質(zhì)量濃度，μg/mL；R2=0.999 02）計(jì)算包封率。1.2.4 CyMCs 的抗氧化性測定 配制硫酸亞鐵溶液（9.0 mmol/L）、乙醇-水楊酸溶液（9.0 mmol/L）和過氧化氫溶液（8.8 mmol/L）。采用水楊酸法［8］測定包封率最佳條件下的CyMCs 對(duì)羥基自由基的清除效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 FT-IR 分析

圖1 是BMCs，Cy 及CyMCs 的FT-IR 圖。由BMCs 的譜線可 見，3 447 cm-1處 是-OH 和-NH2的伸縮振動(dòng)峰，2 919 cm-1和2 850 cm-1處是-CH和-CH2的伸縮振動(dòng)峰（此圖中省略），1 629 cm-1處是殼聚糖的-NH3+（1 651 cm-1）與海藻酸鈉的-COO-（1 613 cm-1）通過靜電吸附作用所產(chǎn)生的吸收峰［9］；在Cy 的譜線中，1 516 cm-1處是Cy 的B環(huán)上2 個(gè)-OH 伸縮振動(dòng)峰，由此可見紫甘藍(lán)富含矢車菊素［10］，1 630 cm-1和1 454cm-1處是Cy 苯環(huán)中的C＝C 伸縮振動(dòng)［11-12］，1 075 cm-1處是Cy 的C 環(huán)中C-O-C 的特征吸收峰［12］；在CyMCs 的譜線中，可以看到不僅海藻酸鈉和殼聚糖對(duì)應(yīng)的吸收峰沒有消失，而且還保留了Cy 在1 454 cm-1處的特征吸收峰，說明Cy 被成功包封且未與壁材發(fā)生反應(yīng)。

圖1 BMCs、Cy 和CyMCs 的FT-IR 圖Fig.1 FT-IR spectra of BMCs，Cy and CyMCs

2.2 影響CyMCs 包封率的因素

2.2.1 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)包封率的影響 保持殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，Cy 加入量為10 mg，攪拌溫度為35 ℃，攪拌速率為300 r/min，海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%，0.8%，1.0%，1.2%和1.4%的條件下制備微膠囊，并測定其包封率，如圖2（a）所示。

圖2 不同因素質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)包封率的影響：（a）海藻酸鈉，（b）氯化鈣，（c）殼聚糖Fig.2 Effects of different mass fractions on encapsulation efficiency：（a）alginate，（b）calcium chloride，（c）chitosan

由圖2（a）可以看出，當(dāng)海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由0.6%增加到1.0%時(shí)，包封率相應(yīng)地從78.8%增加到93%。其原因可能是隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，與殼聚糖反應(yīng)機(jī)率上升，形成的微膠囊變得緊實(shí)，有利于Cy 的包埋。同時(shí)，當(dāng)Cy 海藻酸鈉溶液黏度增加時(shí)，增大了溶液對(duì)Cy 的束縛作用，使得Cy 流失減少；繼續(xù)增大海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，此時(shí)參與反應(yīng)的氯化鈣和殼聚糖相對(duì)不足，所制備的微膠囊結(jié)構(gòu)比較蓬松而且多孔，容易破裂，在成型過程中造成Cy 過多流失［13］，導(dǎo)致包封率從93%下降到84%。同時(shí)，當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí)，容易造成Cy 海藻酸鈉溶液體系黏度過大，不利于與殼聚糖和氯化鈣進(jìn)行反應(yīng)，導(dǎo)致包封率降低［14］。

2.2.2 氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)包封率的影響 鈣離子作為一種螯合劑，其原子直徑為1.14×10-10m，可以與海藻酸鈉分子中的古羅糖醛酸殘基在海藻酸鈉基質(zhì)內(nèi)部形成二維的鍵合結(jié)構(gòu)［15］。當(dāng)鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小時(shí)，可以形成絮狀的無規(guī)結(jié)構(gòu)，當(dāng)鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí)，可以形成凝膠。實(shí)驗(yàn)過程中，保持海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，Cy 添加量為10 mg，攪拌溫度為35 ℃，攪拌速率為300 r/min，在氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%，0.5%，1.0%，2.0%，3.0%，4.0%和5.0%的條件下制備微膠囊，測定微膠囊的包封率，如圖2（b）所示。

由圖2（b）可知，當(dāng)氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，與海藻酸鈉形成的絡(luò)合點(diǎn)較少，此時(shí)雖能成球狀微膠囊，但是微膠囊的機(jī)械強(qiáng)度偏小，在攪拌和干燥過程中微膠囊容易破裂，導(dǎo)致Cy 的包封率普遍不高；然而，當(dāng)氯化鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從1%增加到5%時(shí)，其包封率從97%下降到67%。其原因可能是溶液中的鈣離子與海藻酸鈉絡(luò)合的位點(diǎn)越多，形成的海藻酸鈣微膠囊的結(jié)構(gòu)越緊密，球形度越好。同時(shí)，微膠囊內(nèi)部空腔的體積也會(huì)減小，對(duì)微膠囊內(nèi)部的Cy 溶液形成一定的擠壓，導(dǎo)致包封的Cy 被排斥，造成包封率偏低［15］。通過鈣離子滴定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鈣離子始終處于過量，不能完全參與海藻酸鈉與鈣離子的絡(luò)合反應(yīng)，因此海藻酸鈣微膠囊的包封率與鈣離子的質(zhì)量無關(guān)，只與鈣離子的質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在一定的關(guān)聯(lián)。

2.2.3 殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)包封率的影響 保持海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，Cy 添加量為10 mg，攪拌溫度為35 ℃，攪拌速率為300 r/min，在殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，0.3%，0.5%，0.7%和0.9%的條件下制備微膠囊，并測定其包封率，如圖2（c）所示。

由圖2（c）可知，當(dāng)殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.7%時(shí)，體系中可參與反應(yīng)的殼聚糖處于不飽和狀態(tài)，此階段中隨著殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，更多的與海藻酸鈉的-COO-結(jié)合，微膠囊壁逐漸變厚，強(qiáng)度增加，使其包封率增加。此后，再增加殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，會(huì)有部分殼聚糖分子進(jìn)入到微膠囊的內(nèi)部，形成更多的交聯(lián)點(diǎn)［13］，此時(shí)微膠囊的機(jī)械強(qiáng)度會(huì)有一些增加，但是對(duì)Cy的包封會(huì)出現(xiàn)不利影響。

2.3 CyMCs 的抗氧化特性

取在海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的條件下制備的最佳包封率的CyMCs 進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)，制備樣品的包封率為97.42%，載藥率為5.4%。CyMCs對(duì)羥基自由基的清除率如圖3 所示。

圖3 CyMCs 對(duì)羥基自由基的清除率Fig.3 Scavenging rate of hydroxyl radical by CyMCs

由圖3 可以看出，CyMCs 對(duì)羥基自由基存在清除作用，且隨著CyMCs 的質(zhì)量濃度增加，對(duì)羥基自由基的清除效果也不斷增強(qiáng)，通過擬合曲線y=0.530x+4.127（x 為CyMCs 的質(zhì)量濃度，μg/mL；R2=0.996）計(jì)算得出CyMCs 對(duì)羥基自由基的半數(shù)清除質(zhì)量濃度為84 μg/mL。由此可見，實(shí)驗(yàn)中所制備的CyMsC 對(duì)羥基自由基的清除能力明顯要優(yōu)于食品工業(yè)中常用的抗氧化劑抗壞血酸（半數(shù)清除質(zhì)量濃度為622.3 μg/mL）［16］。

2.4 形貌分析

CyMCs 的形貌如圖4 所示。由圖4 可以看出，CyMCs 與無色透明的空白微膠囊相比，具有鮮艷的色澤，說明微膠囊對(duì)Cy 成功進(jìn)行了包封；從形貌上看，制備的CyMCs 呈球形，表面光滑，大小均一。在濕態(tài)情況下，微膠囊的直徑約為3 mm；在干態(tài)情況下，微膠囊的直徑約為1.3 mm。冷凍干燥后的CyMCs 有所收縮，表面變得有些粗糙，其原因是海藻酸鈉和殼聚糖聚電解質(zhì)復(fù)合膜形成了不規(guī)則的纖維化表面［17］。但囊壁結(jié)構(gòu)維持完整，保持了一定的機(jī)械強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)了微膠囊對(duì)Cy 的包封。

圖4 CyMCs 微膠囊的形貌：（a）濕態(tài)，（b）凍干后Fig.4 Morphologies of CyMCs：（a）wet state，（b）after freeze-drying

3 結(jié) 論

利用微膠囊技術(shù)對(duì)Cy 成功進(jìn)行了包封，通過單因素實(shí)驗(yàn)，確定在海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，制備的CyMCs 包封率最高可達(dá)97.42%；對(duì)CyMCs 進(jìn)行了抗氧化性實(shí)驗(yàn)表明，CyMCs 對(duì)羥基自由基清除率達(dá)50%時(shí)的質(zhì)量濃度為84 μg/mL。將Cy 微囊化達(dá)到了提高Cy 穩(wěn)定性的目的，可延長易氧化食品的保質(zhì)期。