苗雅慧 游韓莉 郜銀濤 張凌云

(森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))，北京，100083)

HAP(histone or heme-associated protein)也叫做NF-Y(nuclear factor-Y)，是由3個(gè)亞基聚合而成的一類轉(zhuǎn)錄因子，包括NF-YA(HAP2)、NF-YB(HAP3)、NF-YC(HAP5)。這3個(gè)亞基可以形成異源三聚體，與CCAAT特異結(jié)合，共同參與下游靶基因啟動(dòng)子DNA的結(jié)合與調(diào)控[1]。研究發(fā)現(xiàn)，HAP家族參與了葉綠體的生物發(fā)生、脂肪酸生物合成、花期、胚胎形成以及非生物脅迫過程等過程[2-7]，這其中大多基于HAP家族單個(gè)亞基進(jìn)行功能探索。例如，大豆(Glycinemax)NF-YC2基因和小麥(TriticumaestivumL.)NF-YC3/5/8/9的表達(dá)受光調(diào)控，且GmNF-YC2在開花調(diào)節(jié)中起重要作用[8-9]；在擬南芥中過表達(dá)NF-YB2可以加速細(xì)胞分裂，促進(jìn)主根的伸長(zhǎng)[10]；楊樹(Populusdeltoides)PdNF-YB7能被滲透脅迫與ABA誘導(dǎo)，參與了植物對(duì)干旱的響應(yīng)[11]。HAP家族調(diào)控的下游靶基因也陸續(xù)鑒定出來，例如擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtHAP5A可以通過與AtXTH21啟動(dòng)子上CCAAT順式作用元件結(jié)合，調(diào)控植株對(duì)冷脅迫的響應(yīng)[12]。

青杄(Piceawilsonii)是松科(Pinaceae)云杉屬常綠針葉樹種，又名華北云杉，為中國(guó)特有樹種，且被多個(gè)地區(qū)列為水源涵養(yǎng)林及用材林的主要造林和更新樹種[13-14]。本課題組前期在Ca2+誘導(dǎo)的青杄花粉cDNA文庫(kù)中篩選得到基因PwHAP5，發(fā)現(xiàn)其與PwFKBP12互作參與花粉管的導(dǎo)向調(diào)節(jié)[15]。另外PwHAP5能夠響應(yīng)干旱、鹽漬等非生物逆境脅迫[16]，但其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

我們對(duì)青杄PwHAP5基因和擬南芥AtHAP5基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較分析，發(fā)現(xiàn)PwHAP5氨基酸序列與AtHAP5氨基酸序列的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域保守[15]。對(duì)AtHAP5的候選靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，A37、HSFA2很可能是AtHAP5的靶基因。A37又被稱為PDX1.2，編碼一個(gè)具有磷酸吡哆醛合成酶活性的蛋白質(zhì)，參與了植物對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)過程[17-18]。在熱脅迫下，HSFA2屬于最強(qiáng)烈誘導(dǎo)的蛋白，在熱激脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[19]。本研究在課題組前期研究基礎(chǔ)上，通過酵母單雜交、EMSA、雙熒光素酶等實(shí)驗(yàn)探究PwHAP5和AtHAP5對(duì)A37、HSFA2的調(diào)控作用，旨在豐富并進(jìn)一步闡明HAP5轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 材料與方法

以實(shí)驗(yàn)室保存的哥倫比亞野生型擬南芥，athap5(At1g56170)突變體，AtHAP5同源過表達(dá)和PwHAP5(ACS31831.1)異源過表達(dá)種子為實(shí)驗(yàn)材料，將各株系擬南芥種子用5%次氯酸鈉處理后播種于MS培養(yǎng)基中，黑暗4 ℃春化3 d后置于22 ℃、16 h光周期的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

pEASY-T1載體、Trans1-T1大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)、BL21(DE3)感受態(tài)在北京全式金科技公司購(gòu)買。酵母(Saccharomycescerevisiae)、農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101感受態(tài)購(gòu)自上海唯地生物科技有限公司。EMSA所用到的生物素標(biāo)記探針、DNA鏈或者突變探針均在上海英濰捷基公司合成。pGBKT7、pGADT7、pGADT7-p53、pHis2、pHis2-p53、pAbAi、pAbAi-p53、pCAM1205、pGBKT7-ANAC092以及單熒光素酶實(shí)驗(yàn)載體1300-LUC由本實(shí)驗(yàn)室保存。pGreenII 0800-LUC、pGreenII 62-SK、pSoup-p19載體由清華大學(xué)謝道昕教授惠贈(zèng)。

轉(zhuǎn)錄激活活性分析的步驟參照文獻(xiàn)[20]，簡(jiǎn)要如下：將PwHAP5全長(zhǎng)、AtHAP5全長(zhǎng)以及PwHAP5的N端(1-101)和C端(102-201)分別構(gòu)建到pGBKT7載體上,引物見表1。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化入酵母中，通過在含有10 mmol·L-13-AT的SD/-Trp-His-Ade缺陷型酵母培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況判定轉(zhuǎn)錄激活活性，以pGBKT7-ANAC092為陽(yáng)性對(duì)照[21]。

pHIS2體系酵母單雜交的試驗(yàn)方法參照上海唯地生物科技有限公司說明書。將濃度相同的pHIS2質(zhì)粒和pGADT7質(zhì)粒分別取10 μL和5 μL共轉(zhuǎn)入Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞，在SD/-Trp-Leu酵母缺陷培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。長(zhǎng)出菌落后，在超凈工作臺(tái)中將長(zhǎng)出的菌落用無菌蒸餾水重懸，并將OD600值調(diào)整為0.2，吸取5 μL滴在含有篩選出的3-AT濃度的SD/-Trp-Leu-His的三缺培養(yǎng)基中倒置培養(yǎng)觀察生長(zhǎng)情況。

將HSFA2和A37的啟動(dòng)子全長(zhǎng)以及只含有CCAAT box的啟動(dòng)子片段構(gòu)建到pAbAi載體上。用限制性內(nèi)切酶BstBI酶切線性化pAbAi-HSFA2/A37載體。回收酶切產(chǎn)物，將其轉(zhuǎn)入Y1HGold，用SD/-Ura培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。將陽(yáng)性菌落制備成酵母感受態(tài)，將各pGADT7質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入所制備的含有線性化pAbAi-HSFA2/A37載體的Y1HGold感受態(tài)中，并于SD/-Ura-Leu二缺酵母培養(yǎng)板上生長(zhǎng)。將長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行菌落PCR，將陽(yáng)性菌落稀釋，滴在SD/-Ura-Leu+AbA的酵母培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并進(jìn)行觀察記錄。

蛋白的誘導(dǎo)純化參照文獻(xiàn)[22]。將AtHAP5構(gòu)建到pET-32a載體上，在BL21菌株中表達(dá)。通過篩選不同IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間，發(fā)現(xiàn)最佳誘導(dǎo)條件為IPTG濃度為1 mM，誘導(dǎo)溫度25 ℃，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為7 h。篩選出最佳誘導(dǎo)條件后，進(jìn)行大量誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)化。利用上海碧云天生化科技有限公司的His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)與純化，與His標(biāo)簽蛋白融合表達(dá)，進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。EMSA實(shí)驗(yàn)參考上海碧云天生化科技有限公司的EMSA試劑盒說明書。

單熒光素酶試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[22]。將pCM1205-AtHAP5和1300-LUC-HSFA2/A37質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株GV3101。將等體積的pCM1205-AtHAP5的1300-LUC-HSFA2/A37農(nóng)桿菌混合后注射到一個(gè)月大的煙草葉片中，培養(yǎng)48 h后在熒光成像系統(tǒng)(Andor iXon)中進(jìn)行觀察和拍照。

雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[23]、[24]。將pGreenII0800-LUC-HSFA2/A37(p0800-HSFA2/A37)和pGreenII 62-SK-AtHAP5 (p62-AtHAP55)的各組合分別共轉(zhuǎn)入含有pSoup-p19質(zhì)粒的農(nóng)桿菌中，并進(jìn)行煙草葉片注射。利用Promega化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀，進(jìn)行LUC和RLUC的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

利用北京艾德萊生物技術(shù)有限公司的RNA提取試劑盒提取植株的總RNA，并通過oligo(dT)法將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA[25]。利用所設(shè)計(jì)的RT引物(表1)進(jìn)行RT-qPCR，以擬南芥ACTIN2/8基因作為內(nèi)參基因。試驗(yàn)分別設(shè)置2次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。

表1 所用引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄激活活性分析

圖1顯示，轉(zhuǎn)化空載體pBD、pBD-PwHAP5以及pBD-AtHAP5的酵母不能在SD/-Trp-His-Ade+10 mmol·L-13-AT缺陷型培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)化陽(yáng)性對(duì)照pBD-ANAC092的酵母可以在SD/-Trp-His-Ade+10 mmol·L-13-AT缺陷型培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，且可以使X-α-gal變藍(lán)，表明PwHAP5以及AtHAP5全長(zhǎng)沒有轉(zhuǎn)錄激活活性。此外將PwHAP5分為N端和C端兩段，發(fā)現(xiàn)PwHAP5的N端和C端均無轉(zhuǎn)錄激活活性。

空載體pBD和pBD-ANAC092分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，圖中蛋白后面的數(shù)字指示片段的位置。

圖1轉(zhuǎn)錄激活活性分析

2.2 酵母單雜交試驗(yàn)

2.2.1 pHis2體系酵母單雜交

在前期試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)3-AT濃度高達(dá)300 mmol·L-1時(shí)，才能消除組氨酸的背景表達(dá)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用的3-AT濃度為300 mmol·L-1。在含有300 mmol·L-13-AT的SD/-Trp-Leu-His三缺培養(yǎng)基中，除了轉(zhuǎn)入的陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pHIS2-p53+pAD-p53的酵母菌株可以生長(zhǎng)，而其他實(shí)驗(yàn)組都沒有長(zhǎng)出菌落(圖2)。由此說明，在酵母pHIS2體系中，AtHAP5與PwHAP5均不能與HSFA2、A37啟動(dòng)子結(jié)合。

2.2.2 pAbAi體系酵母單雜交

為了進(jìn)一步確認(rèn)pHIS2體系酵母單雜交的結(jié)果，又通過pAbAi體系進(jìn)行了酵母單雜交。首先對(duì)pAbAi體系中pAbAi-HSFA2/A37的金擔(dān)子素(AbA)的背景表達(dá)進(jìn)行了測(cè)試，如圖3A。當(dāng)AbA濃度為500 ng·mL-1時(shí)，已經(jīng)能抑制陽(yáng)性對(duì)照pAbAi-P53pro的生長(zhǎng)，然而即使加大AbA的濃度到1 000 ng·mL-1時(shí)仍然抑制不住pAbAi-A37pro、pAbAi-HSFA2pro的AbA背景表達(dá)。由此可見，A37、HSFA2的啟動(dòng)子極有可能被Y1HGold酵母內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別，或其啟動(dòng)子本身存在激活活性，因此啟動(dòng)子的全長(zhǎng)不能用于酵母單雜交的篩選試驗(yàn)。

圖2轉(zhuǎn)化酵母在含有300mmol·L-13-AT的SD/-Trp-Leu-His三缺培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況

由于在pAbAi體系中，A37與HSFA2的啟動(dòng)子全長(zhǎng)不能直接用于酵母單雜交實(shí)驗(yàn)，因此將A37與HSFA2的啟動(dòng)子上含有CCAAT box作用元件的序列片段克隆出來，重新構(gòu)建到pAbAi載體上，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。金擔(dān)子素背景檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)金擔(dān)子素濃度為300 ng·mL-1時(shí)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的背景表達(dá)均被消除了，因此確定金擔(dān)子素的實(shí)驗(yàn)濃度為300 ng·mL-1。酵母單雜交結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有陽(yáng)性對(duì)照能在含有300 ng·mL-1的二缺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，陰性對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組沒有明顯菌落出現(xiàn)(圖3B)。由此可見，AtHAP5和PwHAP5不能與所克隆的HSFA2、A37啟動(dòng)子上含有CCAAT box的順式作用元件區(qū)域結(jié)合。

2.3 原核蛋白誘導(dǎo)純化與EMSA試驗(yàn)

采用碧云天生物科技有限公司的His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)與純化，得到目的蛋白(圖4A、B)。在EMSA試驗(yàn)中，設(shè)置了5個(gè)組，分別為陰性對(duì)照(加入探針為CCAAT box突變探針)、樣品反應(yīng)組(加入探針為生物素標(biāo)記探針)、探針冷競(jìng)爭(zhēng)(既有標(biāo)記探針，又有未標(biāo)記探針)、突變探針冷競(jìng)爭(zhēng)(既有標(biāo)記探針，又有未標(biāo)記的突變探針)、Super-shift反應(yīng)(加入His標(biāo)簽蛋白抗體)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各反應(yīng)組中全為自由探針，均未發(fā)現(xiàn)滯后條帶。(圖4C、D)。

通過EMSA、酵母單雜交實(shí)驗(yàn)可知，AtHAP5和PwHAP5不能與所克隆的HSFA2、A37啟動(dòng)子上含有CCAAT box順式作用元件區(qū)域直接結(jié)合。

2.4 熒光素酶試驗(yàn)

單熒光素酶試驗(yàn)中，對(duì)照組空1205+A37、空1205+空1300、1205-AtHAP5+空1300及實(shí)驗(yàn)組1205-AtHAP5+A37的熒光強(qiáng)度沒有明顯差別。然而，在實(shí)驗(yàn)組1205-AtHAP5+HSFA2中熒光強(qiáng)度明顯減弱(圖5)。此外，利用靶基因啟動(dòng)子后連接的熒光素酶基因(LUC)與雙熒光素酶系統(tǒng)中穩(wěn)定表達(dá)的海腎熒光素酶基因(RLUC)熒光信號(hào)強(qiáng)度的比值，進(jìn)行定量分析，如表2所示。在實(shí)驗(yàn)組p62SK-AtHAP5+HSFA2中，LUC/RLUC的比值顯著低于對(duì)照組(空p62+HSFA2)，而在實(shí)驗(yàn)組p62SK-AtHAP5+A37中，LUC/RLUC的比值與對(duì)照組(空p62+A37)沒有顯著差別。因此，AtHAP5對(duì)A37表達(dá)無影響，但對(duì)HSFA2的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用。

表2 雙熒光素酶LUC/RLUC熒光強(qiáng)度比值

注：對(duì)照組為空pGreenII 62-SK+pGreenII 0800-X-LUC，X為靶基因啟動(dòng)子；同列數(shù)據(jù)后*表示差異顯著(p<0.05)。

2.5 基因水平驗(yàn)證調(diào)控作用

2.5.1 AtHAP5各株系中AtHAP5、HSFA2、A37的表達(dá)

為進(jìn)一步驗(yàn)證熒光素酶試驗(yàn)的結(jié)果，通過RT-qPCR試驗(yàn)對(duì)不同AtHAP5株系中HSFA2、A37的表達(dá)量進(jìn)行了研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AtHAP5過量表達(dá)時(shí)，HSFA2的表達(dá)量受到顯著的抑制作用。在athap5突變體中，AtHAP5和HSFA2的表達(dá)量與野生型(CW)植株相比輕微下降，而A37的表達(dá)并無顯著變化(表3)。

表3 AtHAP5各株系A(chǔ)tHAP5、HSFA2、A37的相對(duì)表達(dá)量

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.5.2PwHAP5各株系中PwHAP5、HSFA2、A37的表達(dá)

通過RT-qPCR試驗(yàn)分別分析在野生型與PwHAP5異源過表達(dá)株系中PwHAP5、HSFA2、A37的表達(dá)量。研究結(jié)果表明，在過表達(dá)PwHAP5株系中HSFA2、A37的表達(dá)量沒有顯著變化(表4)。

表4 PwHAP5過表達(dá)株系PwHAP5、HSFA2、A37的相對(duì)表達(dá)量

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；*表示差異顯著(p<0.05)；CW代表野生型。

3 討論

根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控方式的不同可以將其分為轉(zhuǎn)錄抑制子和轉(zhuǎn)錄激活子[26]。在本研究中，通過轉(zhuǎn)錄激活活性分析發(fā)現(xiàn)，PwHPA5和AtHAP5全長(zhǎng)沒有轉(zhuǎn)錄激活活性，且PwHAP5的N端和C端均無轉(zhuǎn)錄激活活性(圖1)。Hao et al.[27]在研究NAC轉(zhuǎn)錄因子的激活活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，大豆NAC轉(zhuǎn)錄因子GmNAC20的C端具備轉(zhuǎn)錄激活活性，而全長(zhǎng)不具備轉(zhuǎn)錄激活活性，因?yàn)槠涞鞍譔端存在一個(gè)NARD抑制結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域抑制了C端的轉(zhuǎn)錄激活活性。因此，我們推測(cè)PwHPA5和AtHAP5可能作為轉(zhuǎn)錄抑制子發(fā)揮作用，或需與NF-Y家族的其他亞基結(jié)合，發(fā)揮激活功能[28-31]。

植物HAP復(fù)合體已經(jīng)被廣泛地證明在酵母與植物中能與CCAAT box結(jié)合。例如，Shi et al.[12]在探究AtHAP5A下游靶基因及其功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，AtHAP5A作為轉(zhuǎn)錄因子能夠直接通過與CCAAT結(jié)合調(diào)控AtXTH21的表達(dá)，并參與了冷脅迫抗性調(diào)控過程。我們的研究結(jié)果顯示AtHAP5對(duì)HSFA2的表達(dá)具有抑制作用，顯示HSFA2可以作為AtHAP5的下游靶基因，受AtHAP5負(fù)調(diào)控發(fā)揮作用。然而，EMSA和酵母單雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AtHAP5不能直接作用于HSFA2的啟動(dòng)子，說明AtHAP5作為HSFA2的上游調(diào)控因子，并不是直接與HSFA2的啟動(dòng)子結(jié)合，其調(diào)控過程需要其他亞基或蛋白的參與。之前多數(shù)的研究表明，NF-Y亞基發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用并不是獨(dú)立的。NF-YB和NF-YC首先在細(xì)胞質(zhì)中形成二聚體，然后一起轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中與NF-YA形成三聚體發(fā)揮調(diào)控作用[28-31]。此外，NF-YC亞基也可以通過與其他非NF-Y家族轉(zhuǎn)錄因子如AB15發(fā)生相互作用發(fā)揮調(diào)控作用[32]。HIKARU et al.[31]發(fā)現(xiàn)，DPB3-1(NF-YC10)能夠與NF-YA以及NF-YB亞基形成三聚體，這個(gè)三聚體又可以與DREB2A相互作用，增強(qiáng)DREB2A對(duì)下游靶基因HSFA3的表達(dá)調(diào)控作用，進(jìn)而調(diào)控下游熱脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)。擬南芥bZIP28可以與NF-YB3/NF-YC2/NF-YA4形成復(fù)合體調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激響應(yīng)[30]，NF-YC2/LEC1/BbZIP67參與種子萌發(fā)，可以激活A(yù)BA響應(yīng)元件[33]，CONSTANS(CO/B-BOX PROTEIN1 BBX1)蛋白能夠與NF-YB2/NF-YC3形成復(fù)合體，與FLOWERINGLOCUST啟動(dòng)子上CORE元件結(jié)合，調(diào)控花期[34]。因此我們推測(cè)，AtHAP5對(duì)于HSFA2的調(diào)控作用可能是需要NF-Y家族其他亞基或其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同完成。

Park et al.[35]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的NF-YA亞基可以與酵母中的NF-YB、NF-YC亞基形成三聚體，與CCAAT順式作用元件結(jié)合，說明不同物種NF-Y家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)具有相似的生化特性，也暗示其在生物體中的功能保守。利用同源基因之間的相似性，有利于基因調(diào)控機(jī)制的探索與比較，Yu et al.[15]通過多序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，PwHAP5氨基酸序列與AtHAP5氨基酸序列的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域保守，相似性達(dá)52.09%，因此推測(cè)它們?cè)诠δ苌弦簿哂斜Ｊ匦浴iu et al.[36]發(fā)現(xiàn)鹽芥(Eutremasalsugineum)EsNAC1異源株系顯示出與擬南芥同源基因RD26過表達(dá)株系不同的表型，且異源株系通過調(diào)控不同靶基因的表達(dá)來增強(qiáng)植株的非生物脅迫性。在本研究中AtHAP5對(duì)HSFA2的在體內(nèi)表達(dá)具有抑制作用，而PwHAP5對(duì)HSFA2的表達(dá)沒有顯著影響。由此推測(cè)PwHAP5在進(jìn)化上與AtHAP5功能及作用存在差異。

4 結(jié)論

青杄PwHAP5與其同源基因擬南芥AtHAP5全長(zhǎng)以及PwHAP5的N端與C端均沒有轉(zhuǎn)錄激活活性，PwHAP5與AtHAP5不能直接作用于HSFA2和A37的啟動(dòng)子。AtHAP5對(duì)HSFA2的在體內(nèi)表達(dá)具有抑制作用，可能負(fù)調(diào)控AtHSFA2表達(dá)。PwHAP5對(duì)HSFA2的表達(dá)沒有顯著影響，

顯示其在進(jìn)化上與AtHAP5功能及作用存在差異。