靳貝貝 裴香萍 梁惠珍

摘要 目的：建立門氏柴胡理中顆粒定性定量質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制方法。方法：采用薄層色譜法對門氏柴胡理中顆粒制劑中柴胡、黃芩進(jìn)行薄層鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）對柴胡理中顆粒中的黃芩苷進(jìn)行含量測定，色譜柱為Diamonsil-C18色譜柱（200 mm×4.6 mm，5.0 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%醋酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL.結(jié)果：柴胡、黃芩薄層色譜斑點(diǎn)分離清晰，陰性均無干擾;回歸方程為y=2 907 186.561 0x+21 224.436 6（r=0.999 8），黃芩苷在0.12～1.20 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。平均加樣回收率為99.45%，RSD為2.48%。結(jié)論：建立的方法方便、可靠，可作為門氏柴胡理中顆粒的薄層鑒別和含量測定質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞 門氏柴胡理中顆粒;薄層色譜;高效液相色譜法;含量測定;柴胡;黃芩;半夏;黃芩苷

Abstract Objective：To establish a qualitative and quantitative quality standard control method for the Menshi Chaihu Lizhong Granules.Methods：The Bupleurum chinense and Radix Astragali were qualitatively identified by thin-layer chromatography by the Menshi Chaihu Lizhong Granules.The content of baicalin in Menshi Chaihu Lizhong was determined by high performance liquid chromatography.Diamonsil-C18 column（200 mm×4.6 mm，5.0 μm）was used.The mobile phase was gradient eluted with methanol-0.1% aqueous acetic acid，the flow rate is 1.0 mL/min，the detection wavelength is 280 nm，the column temperature is 25 ℃，and the injection volume is 10 μL.Results：The chromatographic spots of Bupleurum chinense and Radix Scutellariae were clearly separated and there was no interference in the negative; the regression equation was y=2 907 186.561 0x+21 224.436 6（r=0.999 8），and baicalin had a good linear relationship in the range of 0.12 μg-1.20 μg.The average recovery was 99.45% and the RSD was 2.48%.Conclusion：The established method is reliable and scientific，and can be used for thin-layer identification andqualitative and quantitative quality control of the Menshi Chaihu Lizhong Granules.

Keywords Menshi Chaihu Lizhong Granules; TLC; HPLC; Content determination; Bupleurum chinense; Scutellariae; Pinellia; Baicalin

門氏柴胡理中顆粒為山西首屆名中醫(yī)門九章的臨床經(jīng)方制劑，由柴胡、半夏、黃芩等多味中藥組成，具有清肝補(bǔ)脾利膽等功效;主治往來寒熱，疲乏倦怠，心煩易怒，不欲飲食，舌紅苔白，脈弦者方中柴胡主要化學(xué)成分有皂苷類、揮發(fā)油類、黃酮類等[1]，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、抗菌、抗病毒等藥理活性[2-6];黃芩主要化學(xué)成分有黃酮類、揮發(fā)油等[7]，具有抗病毒、抗炎等多種藥理作用[8-9]。半夏主要化學(xué)成分有生物堿類、聚醇類、其他化合物等[10]，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗胃潰瘍和改善胃功能、抗腹瀉等藥理作用[11-13]?，F(xiàn)在藥理學(xué)研究表明柴胡與黃芩配伍解熱抗炎作用增強(qiáng)并具有抗抑郁作用[14-15]。此經(jīng)方臨床用量大，但多以傳統(tǒng)湯劑為主，有煎煮不便、不易攜帶等缺點(diǎn)，而中藥顆?？芍苯記_服，適應(yīng)快節(jié)奏社會(huì)生活，因此為滿足社會(huì)需求，將此經(jīng)方制成顆粒劑，本試驗(yàn)主要對門氏柴胡理中顆粒進(jìn)行定性定量控制，對制劑中柴胡、半夏、黃芩進(jìn)行薄層鑒別，并采用高效液相色譜法（HPLC）測定門氏柴胡理中顆粒中黃芩苷的含量，建立門氏柴胡理中顆粒定性定量質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀及2998PDA光電二極管矩陣檢測器（美國Waters公司，型號：Waters-e2695）;普利賽斯十萬分之一電子天平（杭州俊升科學(xué)器材有限公司，型號：EP/ES125SM）;萬分之一電子天平（上海析平科學(xué)儀器有限公司，型號：XP）;小型萬能粉碎機(jī)（濟(jì)南科翔實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，型號：FW80）;紫外儀（北京六一生物科技有限公司，型號：WD-9403C）;實(shí)驗(yàn)用干燥箱（上海艾測科技有限公司，型號：A231399）;電熱恒溫水浴鍋（南京威美特科學(xué)儀器有限公司，型號：JHF1-DK-S28）;超聲波清洗器（濟(jì)寧科源超聲波設(shè)備有限公司，型號：KC-240）。

1.2 試劑 柴胡皂苷a對照品（批號：110777-201510，純度為93.2%），柴胡皂苷d對照品（批號：110778-201510，純度為95.8%），黃芩苷對照品（批號：110715-201619，純度為93.5%），漢黃芩素對照品（批號：111514-201605），黃芩素對照品（批號：111595-201607，純度為98.5%）均購于中國食品藥品檢定研究院;薄層層析硅膠G板、聚酰胺薄膜（浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠，規(guī)格：10 cm×10 cm），純水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 分析樣品 門氏柴胡理中顆粒（批號：20171012、2171014、20171015）由山西黃河藥業(yè)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 柴胡薄層鑒別 取門氏柴胡理中顆粒8 g，研細(xì)，加入50 mL甲醇使溶解，超聲15 min，濾過，將濾液揮干后，濾渣加入5 mL水溶解濾渣，溶解后加入水飽和正丁醇液20 mL，置于分液漏斗中振搖萃取3次，將正丁醇液合并，揮干正丁醇液，濾渣加甲醇定容至5 mL，作為供試品溶液[16]。取柴胡皂苷a和柴胡皂苷d對照品一定量，加甲醇配制成濃度為0.5 mg/mL的對照品溶液。另取缺柴胡的門氏柴胡理中顆粒陰性樣品，同法制備柴胡陰性對照溶液。參照2015年版《中華人民共和國藥典》通則0502試驗(yàn)[17]，分別吸取上述溶液各12 μL、5 μL、12 μL，點(diǎn)于同一薄層層析硅膠G板，展開劑為乙酸乙酯-乙醇-水（8∶2∶1），展開，取出，揮干展開劑，噴10%的硫酸乙醇溶液，105 ℃下加熱至斑點(diǎn)清晰，在供試品與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性無干擾，結(jié)果見圖1。

2.1.2 黃芩薄層色譜 取門氏柴胡理中顆粒8 g，研細(xì)，加入50 mL乙酸乙酯-甲醇（3∶1）的溶液，采用加熱回流法加熱提取30 min，放冷至室溫，將濾液揮干后，濾渣加入5 mL甲醇溶解，取上清液作為供試品溶液。另同法制黃芩對照藥材溶液[18]。再制備濃度為0.5、1.0、0.5 mg/mL的黃芩素對照品、黃芩苷對照品、漢黃芩素對照品溶液。另取缺黃芩的門氏柴胡理中顆粒陰性樣品，同法制備黃芩陰性對照溶液。吸取上述溶液3 μL、2 μL、3 μL、3 μL，點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，展開劑為甲苯-丙酮-甲醇-乙酸（8∶1∶1∶1），預(yù)飽和10 min，展開，取出，揮干展開劑，置紫外光燈（365 nm）下檢視。在供試品與黃芩對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn);并與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯3個(gè)相同的暗色斑點(diǎn)，且陰性無干擾，結(jié)果見圖2。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%醋酸溶液（B），梯度洗脫，洗脫程序見表1;流速：1.0 mL/min;檢測波長：280 nm;柱溫：25 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 取黃芩苷對照品一定量加甲醇制成濃度為0.12 mg/mL的黃芩苷對照品溶液[19]。

2.2.3 供試品溶液的制備 稱取門氏柴胡理中顆粒5.0 g，稱定重量，加甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理20 min，放冷，以甲醇補(bǔ)足失重，濾過，取續(xù)濾液為供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取缺黃芩的門氏柴胡理中顆粒陰性樣品，按照“2.2.3”的方法制成黃芩陰性對照溶液。

2.2.5 專屬性考察 分別將上述制備的溶液按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件下進(jìn)樣檢測，進(jìn)樣量為10 μL，試驗(yàn)結(jié)果表明，陰性無干擾。見圖3。

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下的對照品儲(chǔ)備溶液，分別取0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 mL稀釋至2mL容量瓶中，各精密吸取10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件注入高效液相色譜儀檢測，記錄峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=2 907 186.561 0x+21 224.436 6（r=0.999 8）。結(jié)果表明，黃芩苷在0.12～1.20 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件精密吸取對照品溶液（0.06 mg/mL）10 μL，進(jìn)樣6次檢測，記錄峰面積，黃芩苷的峰面積RSD為0.84%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下的供試品溶液10 μL分別于0、2、4、8、10、12 h時(shí)進(jìn)行進(jìn)樣檢測，記錄峰面積值，黃芩苷的峰面積RSD為2.07%，表明在12 h內(nèi)樣品基本穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批樣品5 g，精密稱定，共6份，按照“2.2.3”項(xiàng)下的制備方法制備，按照“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測定，樣品平均含量為0.526 6 mg/g，RSD為2.13%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取樣品，研細(xì)，精密稱取2.5 g，加入黃芩苷對照品1.3 mg，加入甲醇定容至50 mL，超聲20 min，按照“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測定，平均加樣回收率為99.45%，RSD為2.48%，結(jié)果見表2。

3 討論

柴胡的薄層鑒別過程中，供試品制備中樣品加甲醇超聲處理后，濾過，濾液濃縮后作為供試品，薄層色譜結(jié)果斑點(diǎn)拖尾嚴(yán)重，后查閱相關(guān)文獻(xiàn)[16]，調(diào)整供試品制備方法，結(jié)果顯示柴胡皂苷d斑點(diǎn)幾乎看不到，但柴胡皂苷a斑點(diǎn)清晰，參考文獻(xiàn)[20]，發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷d在水煎煮液中會(huì)全部轉(zhuǎn)化為柴胡皂苷b2。

黃芩薄層鑒別中展開劑參照《中華人民共和國藥典》2015版黃芩項(xiàng)下的薄層色譜條件[18]，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）為展開劑，飽和30 min，展開后，斑點(diǎn)拖尾嚴(yán)重，后參考文獻(xiàn)報(bào)道，多次調(diào)整展開條件更換展開劑，以甲苯-丙酮-甲醇-冰乙酸（8∶1∶1∶1）為展開劑，結(jié)果顯示斑點(diǎn)分離清晰。

色譜條件篩選時(shí)，實(shí)驗(yàn)初期分別以乙腈-0.1%醋酸溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行了考察，供試品中黃芩苷色譜峰峰形較差，后選用甲醇-0.1%醋酸水進(jìn)行梯度洗脫時(shí)色譜峰分離度高，峰形良好且專屬性、重復(fù)性較好，可為建立門氏柴胡理中顆粒定性定量質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供可靠的方法。

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（2019-01-07收稿 責(zé)任編輯：張雄杰）