陳炬蓉 江夏薇 劉文洪

摘要：宏基因組學(xué)在探索新的基因和物種、調(diào)查微生物群落結(jié)構(gòu)和功能上取得了很大成就，被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。本文以酸性礦山廢水為例，論述宏基因組學(xué)技術(shù)在環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)以及抗生素抗性基因分布研究中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：宏基因組學(xué);微生物群落結(jié)構(gòu);AMD;抗性基因

宏基因組學(xué)在探索新的基因和物種、調(diào)查微生物群落結(jié)構(gòu)和功能上取得了很大的成就，廣泛地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。酸性礦山廢水（Acidminedrainage，AMD）中含有很高濃度的硫酸根以及有毒的重金屬離子，會(huì)造成地表水和地下水的污染，同時(shí)也危及人類的生命健康[1]。為了防控這種污染的進(jìn)一步危害，需要了解AMD中微生物群落的組成結(jié)構(gòu)以及適應(yīng)環(huán)境變化的能力[2]。因此，本文以宏基因組學(xué)在AMD環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)及抗生素抗性基因分布研究中的應(yīng)用為主，進(jìn)行綜合論述。

一、宏基因組學(xué)概述

目前，較完善的組學(xué)方法是以高通量測(cè)序技術(shù)（羅氏454測(cè)序技術(shù)和Illumina測(cè)序技術(shù)）和基因芯片（GeoChip）技術(shù)為主要技術(shù)的宏基因組學(xué)?；蛐酒夹g(shù)用核酸序列檢測(cè)核酸探針雜交，能夠有所側(cè)重地得到已經(jīng)知道的物種或者他們發(fā)揮作用的基因信息。通過系統(tǒng)分析，可以知道這個(gè)物種或作用分布在哪里，這過程中會(huì)遇到功能基因的干擾，無法發(fā)現(xiàn)未知基因有哪些相似點(diǎn)，故難以定義到新基因，更無法估算生物環(huán)境中的物種和個(gè)體總量。若合理利用高通量測(cè)序技術(shù)，將比較容易地獲得某一特定基因的大量操作分類單元（OTU）及其個(gè)體數(shù)量或者宏基因組中的大片段DNA信息，以此近一步深入了解生境中微生物群落的組成、結(jié)構(gòu)以及遺傳進(jìn)化關(guān)系等。兩種技術(shù)不僅能互相填補(bǔ)優(yōu)缺點(diǎn)，共同為研究提供大量數(shù)據(jù)，還是原位微生物群落功能結(jié)構(gòu)和代謝功能的數(shù)據(jù)來源。

二、宏基因組學(xué)在AMD研究中的應(yīng)用

（一）AMD環(huán)境下微生物群落結(jié)構(gòu)研究

傳統(tǒng)意義上，針對(duì)微生物群落的分析方法是先對(duì)微生物進(jìn)行分離，然后鑒定微生物的生理生化性質(zhì)，以此判斷出微生物所屬種類。在酸性環(huán)境中與利用微生物催化的浸礦技術(shù)中，有著許多自養(yǎng)型嗜酸性細(xì)菌，這些細(xì)菌需要在自然的環(huán)境下才能存活，靠著人工的固體培養(yǎng)基是無法存活的。實(shí)際上，熒光原位雜交法（FISH）、變性梯度凝膠電泳法（DGGE）和PCR克隆法等一些生物技術(shù)，都被用于研究傳統(tǒng)微生物群落的多樣性。但是在分析微生物群落結(jié)構(gòu)和活動(dòng)的分子生物學(xué)方面，這些研究方法有著勞動(dòng)強(qiáng)度過大的嚴(yán)重缺點(diǎn)。因此運(yùn)用最多的是基因芯片技術(shù)[1]。

而微生物法運(yùn)用自然環(huán)境的硫循環(huán)原理，把重金屬離子緩慢儲(chǔ)藏在微生物體內(nèi)。具體過程為先進(jìn)行硫酸鹽還原菌的生物還原反應(yīng)，然后把硫酸鹽一步步變?yōu)閱钨|(zhì)硫。國外許多研究人員利用微生物法處理礦山酸性廢水，如美國蒙大拿州有人嘗試將硫化還原菌運(yùn)用到礦山酸性廢水處理中，最終讓出水pH值成功控制在7.0左右，且Fe、Al、Cd和Cu的去除率也很高[3]。國內(nèi)處理含硫酸根的酸性廢水時(shí)，常采取石灰乳中和的方法，若酸性廢水的pH值低于正常值，原先的石灰乳中和法在處理每噸廢水時(shí)所需石灰量大、處理成本高，還會(huì)產(chǎn)生許多廢渣，可能帶給環(huán)境二次污染[4-5]。

（二）抗性基因研究

基因是遺傳信息的載體，可以實(shí)現(xiàn)自我復(fù)制，將遺傳信息傳給下一代。AMD寡營養(yǎng)生態(tài)系統(tǒng)中的微生物群落中有著能夠和重金屬脅迫、酸脅迫以及胞內(nèi)氧化相抵抗的有關(guān)基因，能夠讓微生物擁有抵抗力，在外界極端條件情況下存活[7]。而比起抗生素抗性基因的研究，現(xiàn)階段重金屬抗性基因在各種環(huán)境中的傳播、分布特征及轉(zhuǎn)歸機(jī)制的研究少之又少[8]。

2.2.1 AMD中存在的天然抗性基因

在AMD中起抑制作用的重金屬離子可以毒化細(xì)菌的生長(zhǎng)，但因?yàn)樯L(zhǎng)環(huán)境比較特殊，這讓浸礦微生物有較高的抵抗能力對(duì)抗許多金屬離子，這也使得A.ferroxidans被用來浸出鈾礦、銅礦、鎳礦等多種金屬硫化礦。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)古菌與其他細(xì)菌之間的差異，主要是在氫離子脅迫的相關(guān)基因上與其他種群相比有較高的表達(dá)，這可以得出古菌在pH低的脅迫下可以更好的適應(yīng)這種狀態(tài)，分析的原因可能是古菌雖然不斷的進(jìn)化，但是卻留下了能夠抵抗氫離子脅迫的原始基因[8]。

2.2.2 抗生素、重金屬抗性基因獲得方式

現(xiàn)有研究表明，在質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子中，找到了能與重金屬對(duì)抗的抗性基因，并且細(xì)菌得到抗性基因的方式是通過抗性基因的水平轉(zhuǎn)移[8]。如SXT/R391家族中可變區(qū)基因的編碼產(chǎn)物對(duì)抗宿主抗生素的耐藥性、重金屬離子抗性等，有著高轉(zhuǎn)移頻率和寬宿主范圍[9]。

研究表明，在AMD中長(zhǎng)期存在的生物具有一些比較特別的基因存在（例如參與重金屬抵御的基因）。根據(jù)16SrRNA基因的信息發(fā)現(xiàn)，這些生物高度相似于新形成的在AMD環(huán)境中的微生物，但是在地理方面，有很遠(yuǎn)距離。這種微生物間的遷移機(jī)制目前還沒有發(fā)現(xiàn)奧秘，譜系間跨越時(shí)間尺度地理隔離的生存模式的相互關(guān)系卻可能依賴于此[9]。

2.2.3細(xì)菌抗生素抗性與重金屬抗性

2.2.3.1協(xié)同抗性

有著相同抗性遺傳載體的抗生素抗性基因和重金屬抗性基因，這兩種抗性基因的相關(guān)性是正相關(guān)，一種增多，另一種會(huì)隨之增多。例如鏈霉素抗性基因（strB）和汞抗性基因（merE）這兩種抗性基因在質(zhì)粒pHCM1上存活，故其中任意一個(gè)基因的增加，緊跟著另一個(gè)基因會(huì)相同規(guī)模的增加[10-12]。

2.2.3.2交叉抗性

細(xì)菌細(xì)胞需要在相同抗性系統(tǒng)中，才能形成抗生素和重金屬的抗性。比如：TetL蛋白在向外界排出四環(huán)素（Tet）的同時(shí)，還能排出Co2+。

2.2.4 外界PH值同抗酸基因表達(dá)的優(yōu)劣地位

微生物在AMD不斷酸化的過程中的作用主要在于通過鐵硫氧化降解礦物獲得能量，導(dǎo)致pH持續(xù)降低，到一定閾值時(shí)，由于其抗酸基因表達(dá)并不強(qiáng)勢(shì)，導(dǎo)致優(yōu)勢(shì)地位可能逐步減弱的假設(shè)[11]。

三、 總結(jié)

宏基因組學(xué)不單單用傳統(tǒng)意義上的純培養(yǎng)技術(shù)，而是用非培養(yǎng)的方法，在有機(jī)選擇新的生物活性物質(zhì)的機(jī)率上有了進(jìn)步，許多新的生物活性物質(zhì)（酶和抗生素等）利用該方法得以發(fā)現(xiàn)。

宏基因組學(xué)在探索新的基因和物種、調(diào)查微生物群落結(jié)構(gòu)和功能上取得了很大的成就。在微生物領(lǐng)域和環(huán)境科學(xué)與工程領(lǐng)域內(nèi)，已經(jīng)變成了一個(gè)熱點(diǎn)和前沿內(nèi)容，比如全球氣候變化、生物地理分布、海洋環(huán)境研究、農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)、人體共生微生物等，特別是生物修復(fù)和資源開發(fā)，每一處都彰顯出其強(qiáng)大的潛力。

參考文獻(xiàn)：

[1]Zhang R B，Wei M M，Ji H G，et al.Application of real—time PCR to monitor population dynamics of defined mixed cultures of moderate thermophiles involved in bioleaching of chalcopyrite[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2009，81（6）：116l-1168.

[2]詹婧.自然生態(tài)恢復(fù)過程中銅尾礦廢棄地微生物學(xué)性質(zhì)及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究[D].合肥：安徽大學(xué)，2010.

[3]宣淮翔.銅尾礦不同氧化層中為生物多樣性研究[D].合肥：安徽大學(xué)，2011.

[4]Hitch TCA， Thomas BJ， Friedersdorff JCA， et al. Deep sequence analysis reveals the ovine rumen as a reservoir of antibiotic resistance genes[J].Environmental Pollution，2018，235：571-575.

[5]Haley B J， Kim S W， Cao H， et al. 265 Genomic and metagenomic analysis of antibiotic resistance in dairy animals[J].Journal of Animal Science，2017，95（S4）：131.

[6]Ju F， Zhang T. Experimental design and bioinformatics analysis for the application of metagenomics in environmental sciences and biotechnology[J].Environmental Science&Technology，2015，49：12628-12640.

[7]孫欣，高瑩，楊云鋒.環(huán)境微生物的宏基因組學(xué)研究新進(jìn)展[J].Biodiversity Science，2013，21（4）：393-400.

[8]韓玉姣.凡口鉛鋅尾礦酸性廢水微生物宏基因組及宏轉(zhuǎn)錄組研究[J].廣東：中山大學(xué)，2013.

[9]周圍，李友國，程國軍，等.1株抗重金屬鉻細(xì)菌的分離?鑒定及抗性基因型的初步研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27（2）：248-250.

[10]羅鵬，何香燕，胡超群.細(xì)菌整合性接合元件SXT/8391研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)，2014（5）：472-473.

[11]宋超，鄭春麗，王建英.微生物硫酸鹽的同化途徑及其與重金屬抗性的關(guān)系[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（11）：6368-6370，6400.

作者簡(jiǎn)介：

陳炬蓉（1997—）女，籍貫：浙江麗水，本科在讀，研究方向：預(yù)防醫(yī)學(xué)。