唐冰雯，郭俐麟

(廣州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510450)

止咳寶片是由紫菀、橘紅、百部、桔梗、枳殼、陳皮、罌粟殼浸膏等十四味藥材制成的中藥成方制劑，具有宣肺祛痰、止咳平喘的功效[1]，可用于外感風(fēng)寒所致的咳嗽、痰多清稀、咳甚而喘。止咳寶片中主要鎮(zhèn)咳成分為罌粟殼浸膏里的嗎啡，另一主要鎮(zhèn)咳成分為黃酮類(lèi)物質(zhì)，其中以橘紅、陳皮中的主要化學(xué)成分橙皮苷為代表。現(xiàn)行《中國(guó)藥典》采用高效液相色譜法測(cè)定了止咳寶片中的無(wú)水嗎啡的含量以控制止咳寶片的含量[1]。而對(duì)另一主要鎮(zhèn)咳成分橙皮苷的定量卻無(wú)明確規(guī)定，缺乏一定的科學(xué)性。同時(shí)可查到的關(guān)于止咳寶片的質(zhì)量控制文獻(xiàn)寥寥無(wú)幾。僅有古星妙等[2]等在藥典基礎(chǔ)上優(yōu)化流動(dòng)相和檢測(cè)波長(zhǎng)，以此測(cè)定止咳寶片中嗎啡的含量。李小燕等[3]采用氮測(cè)定法(蒸餾法)，測(cè)定止咳寶片中氯化銨的含量。但是，止咳寶片中有關(guān)橙皮苷的含量測(cè)定尚仍未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究擬建立一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便快速的定量分析方法來(lái)控制止咳寶片中橙皮苷的含量，以進(jìn)一步提高和完善止咳寶片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試劑

儀器:安捷倫1260高效液相色譜儀，XHDZF-系列真空干燥箱(上海霄漢實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)，SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)，F(xiàn)A1104A萬(wàn)分之一電子天平(上海精天電子儀器有限公司)，KQ5200超聲提取器(昆山市超聲儀器有限公司)。

試劑: 止咳寶片3批，廣東臺(tái)城制藥股份有限公司，批號(hào)為20160404，20160937，20161033；橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)110721-201316)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈(色譜純)，甲醇(色譜純)，購(gòu)自德國(guó)默克股份有限公司；無(wú)水乙醇(分析純)，磷酸(分析純)，甲醇(分析純)，均購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取橙皮苷對(duì)照品27.2mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(橙皮苷濃度為272μg·mL-1)。

2.1.2 供試品溶液的制備

取本品除去包衣，研細(xì)，取約0.2g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇溶液20mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理30min，放冷，稱(chēng)重，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，續(xù)濾液用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

2.1.3 陰性對(duì)照液的制備

取處方組成中除橘紅、枳殼、陳皮外的其余成分制成不含橘紅、枳殼、陳皮的陰性對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下的制備方法處理得陰性対照液。

2.2 色譜條件

Diamond-C18(150mm×4.6mm,2.7μm)色譜柱，流動(dòng)相∶乙腈-水(21∶79)，檢測(cè)波長(zhǎng)為283nm；流速1.0mL·min-1；柱溫35℃；進(jìn)樣量5μL。取對(duì)照品溶液(橙皮苷濃度為21.76μg·mL-1)、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。理論塔板數(shù)按橙皮苷計(jì)應(yīng)不低于2000；保留時(shí)間為7.202min；與相鄰峰的分離度大于1.5；拖尾因子為1.05；陰性對(duì)照樣品對(duì)供試液溶液檢測(cè)無(wú)干擾，說(shuō)明該方法專(zhuān)屬性強(qiáng)。

A.樣品(Sample);B.對(duì)照(Standard);C.陰性(Negative)圖1 對(duì)照品、樣品及陰性的高效液相色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別吸取0.1，0.3，0.4，0.5，0.7，1.0mL的橙皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液，置5mL量瓶中，加甲醇稀釋成橙皮苷濃度為5.44、16.32、21.76、27.20、38.08、54.40μg·mL-1的溶液。依次進(jìn)樣10μL，每個(gè)濃度測(cè)定3次以上。以峰面積(A)為對(duì)照品溶液系列濃度(C)進(jìn)行回歸，得橙皮苷回歸方程A=9.0463C-7.7933，相關(guān)系數(shù)r=0.9990.表明橙皮苷濃度在5.44～54.40μg·mL-1之間與峰面積線性關(guān)系良好。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 橙皮苷的線性與范圍

2.4.2 檢測(cè)限與定量限

取“2.1.1”配置的橙皮苷對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋?zhuān)瑱z測(cè)限是以信噪比(S/N)時(shí)各對(duì)照品進(jìn)樣質(zhì)量濃度，定量限是以信噪比(S/N)為10時(shí)對(duì)照品進(jìn)樣質(zhì)量濃度。結(jié)果橙皮苷的檢測(cè)限、定量限分別為0.0816μg·mL-11、0.272μg·mL-1。

2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取“2.4.1”配制的系列濃度的中間濃度(橙皮苷濃度為21.76μg·mL-1)，按照“2.2”項(xiàng)下的方法連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄橙皮苷峰面積。結(jié)果，橙皮苷峰面積的平均值為192.1，RSD為0.26%，表明儀器精密度良好(見(jiàn)表2)。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液(批號(hào)：20161033)在0，2，4，6，8，12h分別進(jìn)樣5?l，記錄峰面積，結(jié)果橙皮苷峰面積的平均值為191.2，RSD為0.38%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批號(hào)(批號(hào)：20161033)樣品6份，按“2.1.2”方法提取、測(cè)定，結(jié)果橙皮苷平均質(zhì)量濃度為2.757mg·g-1，RSD為1.9%。表明分析方法重復(fù)性良好。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.4.5 加樣回收實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一批號(hào)樣品(批號(hào)：20161033)共6份，加入相應(yīng)量的橙皮苷對(duì)照品，照“2.1.2”方法處理并按“2.2”項(xiàng)下測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。橙皮苷平均回收率為102.6%，RSD=1.5%。結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確可靠。

2.5 樣品測(cè)定

取3批樣品(批號(hào)：20160404；20160937；20161033)，按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 樣品測(cè)定結(jié)果(mg·g-1，n≥3)

3 討論

3.1 提取條件

本實(shí)驗(yàn)考察了分別以甲醇，乙醇為溶劑時(shí)對(duì)待測(cè)成分含量測(cè)定提取的影響，從結(jié)果看出以乙醇為溶劑時(shí)提取率較高，同時(shí)考察了不同濃度的乙醇(50%、70%)的影響，從結(jié)果看出70%乙醇作溶劑時(shí)提取率更高。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還考察了超聲30min、回流30min兩種不同提取方式，結(jié)果顯示該兩種提取方式的提取效果基本一致，且考慮到超聲提取方法具有明顯的簡(jiǎn)潔性，所以采用超聲法進(jìn)行提取。另外，實(shí)驗(yàn)還考察了超聲15、30、45min時(shí)待測(cè)成分含量的變化，結(jié)果表明30min的提取效果較好。故選擇提取條件為70%乙醇超聲提取30min。

3.2 色譜條件

經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)查閱和參考[4-6]，本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水流動(dòng)相體系，結(jié)果顯示采用甲醇-水體系時(shí)柱壓太大且峰的保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，色譜峰面積減少，為了延長(zhǎng)色譜柱使用壽命及改善色譜條件以更好地分離橙皮苷，加上乙腈的洗脫能力大于甲醇，且甲醇的分離效果一般，故采取乙腈作為流動(dòng)相。而采取乙腈-0.1%磷酸水比例時(shí)雜質(zhì)峰太多，間接造成待測(cè)組分色譜峰與相鄰雜峰不完全分開(kāi)。而乙腈-水體系能夠?qū)⒋郎y(cè)組分與雜質(zhì)峰分開(kāi)得較為令人滿(mǎn)意，在保證符合標(biāo)準(zhǔn)的情況下，乙腈-水的效果好于乙腈-0.1%磷酸水。本實(shí)驗(yàn)還考察了流動(dòng)相中不同濃度的乙腈(20%、21%)，結(jié)果顯示采用21%乙腈-水系統(tǒng)的待測(cè)組分色譜峰與雜質(zhì)峰分離度最好，柱效高，故流動(dòng)相確定為21%乙腈-水系統(tǒng)。通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器200～400nm全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)橙皮苷的最大吸收波長(zhǎng)為283nm，為提高靈敏度，檢測(cè)波長(zhǎng)選擇283nm。本實(shí)驗(yàn)還考察了柱溫的選擇(30,35,40℃)，結(jié)果表明柱溫30℃時(shí)提取率較低，柱溫40℃時(shí)峰寬太大，而柱溫為35℃時(shí)組分色譜峰與相鄰雜峰分離度最好，因此柱溫選擇35℃。故，本次實(shí)驗(yàn)的色譜條件是流動(dòng)相為21%乙腈-79%水系統(tǒng)，柱溫為40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為283nm。

3.3 小結(jié)

由橙皮苷的測(cè)定結(jié)果可知，RSD不大于2%，說(shuō)明結(jié)果準(zhǔn)確。三批止咳寶片中橙皮苷的含量分別為2.854,3.318,2.757 mg·g-1，說(shuō)明三批止咳寶片樣品含量相差不大，說(shuō)明該廠商制劑工藝較成熟，生產(chǎn)該制劑的質(zhì)量比較穩(wěn)定。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜法測(cè)定止咳寶片中橙皮苷的含量，方法簡(jiǎn)單、快捷，可為進(jìn)步一完善止咳寶片的質(zhì)量控制提供重要的依據(jù)。