丁麗燕 鄭娟 朱曉曉

摘 要 目的：開展HPLC-ELSD法測(cè)定丙泊酚中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液中溶血磷脂酰膽堿（LPC）和溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）的方法學(xué)驗(yàn)證。 方法：參照國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的丙泊酚乳狀注射液征求意見稿項(xiàng)下LPC和LPE的分析方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：LPC在20.56 ～411.12 mg/ml（R=0.999 8），LPE在5.79～115.71 mg/ml（R=0.999 4）范圍內(nèi)線性良好；他們的定量限濃度分別為23.1 mg/ml、10.3 mg/ml，檢測(cè)限濃度分別為9.2 mg/ml、4.1 mg/ml。兩者加樣回收率RSD分別為0.7%、8%；方法重復(fù)性、耐用性好。結(jié)論：本檢測(cè)方法專屬性強(qiáng)，結(jié)果可靠，重復(fù)性好，可用于丙泊酚中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

關(guān)鍵詞 丙泊酚中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液 溶血磷脂酰膽堿 溶血磷脂酰乙醇胺

中圖分類號(hào)：R927.11； R971.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2020）11-0098-05

Validation of the method for the determination of lysophophatidyl choline and lysophosphatidyl ethanolamine in propofol medium and long chain fat emulsion injection

DING Liyan*， ZHENG Juan， ZHU Xiaoxiao（Shanghai Joy Biopharm CO.， LTD.， Shanghai Engineering Research Center of Lipid Emulsion， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To verify the HPLC-ELSD method for the determination of lysophosphatidyl choline （LPC） and lysophosphatidyl ethanolamine （LPE） in propofol medium and long chain fat emulsion injection. Methods： The method was verified based on a manuscript of request for comments on propofol emulsion injection by Chinese Pharmacopoeia Commission. Results： The standard curves were linear over the range of 20.56-411.12 mg/ml （R=0.999 8） for LPC and 5.79-115.71 mg/ml（R=0.999 4） for LPE. Their quantification limits， detection limits and relative standard deviations （RSD） were 23.1 mg/ml， 9.2 mg/ml and 0.7% for LPC and 10.3 mg/ml， 4.1 mg/ml and 8% for LPE， respectively. The durability and repeatability of the method were good. Conclusion： The method is accuracy， effective and can be used for the quality control of propofol medium and long chain fat emulsion injection.

KEy WORDS propofol medium and long chain fat emulsion injection； lysophosphatidyl choline； lysophosphatidyl

ethanolamine

丙泊酚注射液，作為一種靜脈麻醉藥，以其起效迅速、作用時(shí)間短、清醒快、易于控制和不良反應(yīng)少等特點(diǎn)，被麻醉醫(yī)師廣泛用于全麻誘導(dǎo)，硬膜外麻醉輔助鎮(zhèn)靜，無(wú)痛人流，無(wú)痛胃鏡等領(lǐng)域。其術(shù)后惡心、嘔吐率低等優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)一步奠定其門診手術(shù)首選全麻藥物的地位[1-2]。

卵磷脂具有乳化、分散、助滲等特性，常作為乳化劑、分散劑、穩(wěn)定劑等廣泛應(yīng)用于包括注射在內(nèi)的液體制劑、半固體制劑、固體制劑的制造。卵磷脂在制劑的制備和儲(chǔ)存過程中因受到pH、氧化等原因造成水解而產(chǎn)生溶血磷脂酰膽堿（LPC）和溶血磷脂酰乙醇胺（LPE），造成體系被破壞而降低制劑穩(wěn)定性；另LPC和LPE具有一定的溶血作用，改變細(xì)胞滲透性等，關(guān)系到產(chǎn)品的安全性[3-5]。因此，該指標(biāo)對(duì)于丙泊酚乳狀注射劑的穩(wěn)定性和安全性具有科學(xué)的意義。丙泊酚中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液游離藥物濃度和注射疼痛發(fā)生率較丙泊酚長(zhǎng)鏈脂肪乳顯著降低，且在長(zhǎng)期輸注過程中不易引起高脂癥的發(fā)生，還可減輕肝臟負(fù)擔(dān)，更適用于肺功能不全的患者和嬰幼兒麻醉，是目前市場(chǎng)上最安全有效的丙泊酚制劑[6]。目前國(guó)內(nèi)多家企業(yè)進(jìn)行丙泊酚中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液的仿制研究，為確保產(chǎn)品安全性，國(guó)家藥典委頒布的丙泊酚乳狀注射液征求意見稿從第一版上升至第四版[7]，不斷提升產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。2015年版《中國(guó)藥典》四部收錄“蛋黃卵磷脂（供注射用）”有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)LPC和LPE的檢測(cè)[8]。丙泊酚乳狀注射液征求意見稿也將LPC和LPE作為影響其質(zhì)量的特定雜質(zhì)來(lái)控制。研究初期按丙泊酚中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液原研制劑貝朗產(chǎn)品進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)（JX20100226）的檢測(cè)方法檢測(cè)LPC，發(fā)現(xiàn)存在重現(xiàn)性差、溶液難溶解和耐用性差等問題，且研究初期多數(shù)文獻(xiàn)僅對(duì)LPC的測(cè)定進(jìn)行探討[9-10]。本實(shí)驗(yàn)參考征求意見稿（第四版）丙泊酚乳狀注射液項(xiàng)下LPC和LPE的檢查方法，對(duì)丙泊酚中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液中卵磷脂的分解產(chǎn)物L(fēng)PC和LPE進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 儀器

E2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司，帶2424ELS蒸發(fā)光散射檢測(cè)器）；CPA225D精密天平（德國(guó)Sartorious公司）。

1.2 試藥

丙泊酚中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液（上海喬源生物制藥有限公司，20 ml：200 mg，批號(hào)：BZA171001B、BZA171002B和BZA171003B）；LPC、LPE（99.4%、99.2%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；異丙醇、甲醇、正己烷和正庚烷（色譜純，Merck公司）。

1.3 方法

參考文獻(xiàn)[7]，霧化氣壓力為45 psi，配制溶液所用的溶解液為三氯甲烷-甲醇（2∶1），稀釋液為異丙醇-正庚烷（2∶1）。

1.3.1 溶液制備

1）按文獻(xiàn)[7]配制系統(tǒng)適應(yīng)性溶液。

2）LPE定位溶液 取LPE對(duì)照品4.55 mg置10 ml量瓶，加溶解液適量使溶解，用稀釋液定量稀釋至刻度，搖勻即得。

3）LPC定位溶液 取LPC對(duì)照品4.92 mg，置10 ml量瓶，加溶解液適量使溶解，用稀釋液定量稀釋至刻度，搖勻即得。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取LPC和LPE對(duì)照品適量，加溶解液適量使溶解，用稀釋液定量稀釋制成每1 ml中分別含LPC 0.02、0.04、0.1、0.16、0.2、0.25、0.4 mg和LPE 0.005、0.01、0.025、0.04、0.05、0.06、0.1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。以峰面積對(duì)數(shù)（y）為縱坐標(biāo)，以濃度對(duì)數(shù)（x）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

1.3.3 檢測(cè)限和定量限

當(dāng)信噪比分別為3：1和10：1得到檢測(cè)限和定量限。

1.3.4 專屬性

分別精密稱取LPC對(duì)照品和LPE對(duì)照品適量，分別置2個(gè)量瓶中，用溶解液適量使溶解，用稀釋液稀釋成LPC和LPE的濃度分別約為0.2 mg/ml和0.1 mg/ml的溶液。取供試品1 ml，置10 ml量瓶中，加LPC對(duì)照品溶液4 ml和LPE對(duì)照品溶液2 ml，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻。

1.3.5 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度貯備液：精密稱取LPC對(duì)照品和LPE對(duì)照品適量，用溶解液適量使溶解，用稀釋液分別制備成每1 ml含LPC 0.4 mg和LPE 0.12 mg?？瞻兹芤海喝」┰嚻?.5 ml，置5 ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻。準(zhǔn)確度溶液：取3個(gè)5 ml量瓶，分別加入供試品0.5 ml，再分別加入準(zhǔn)確度貯備液2.0、2.5或3.0 ml，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，制成限度80%、100%、120%三種濃度的溶液。每個(gè)濃度平行配制3份。

1.3.6 精密度

系統(tǒng)精密度：取“專屬性”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察6次峰面積的RSD。重復(fù)性：精密稱取LPC對(duì)照品和LPE對(duì)照品適量，用溶解液適量使溶解，用稀釋液定量稀釋制成每1 ml分別含LPC 0.02、0.04、0.1、0.2 mg和LPE 0.01、0.02、0.05、0.1 mg的溶液。取1 ml供試品溶液，置10 ml量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻。平行配制6份。

1.3.7 耐用性

取1 ml供試品溶液，置10 ml量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻。在不同流速（0.9、1.0、1.1 ml/min）、柱溫（38、40、42 ℃）、流動(dòng)相比例（3%、5%、7%）條件下進(jìn)樣。

1.3.8 溶液穩(wěn)定性

對(duì)照品溶液：精密稱取LPC對(duì)照品和LPE對(duì)照品適量，用溶解液適量使溶解，用稀釋液定量稀釋制成每1 ml分別含LPC 0.2 mg和LPE 0.1 mg的溶液。供試品溶液：取1 ml供試品溶液，置10 ml量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻。對(duì)照品溶液分別在室溫和冷藏（2～8℃）條件下放置，供試品溶液在室溫條件下放置，于0、2 d取樣測(cè)定。

1.3.9 樣品中LPC和LPE的測(cè)定

分別取3批供試品1.0 ml置10 ml量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，測(cè)定LPC和LPE。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性及雜質(zhì)定位

系統(tǒng)適用性溶液中溶血磷脂酰乙醇胺峰與相鄰峰間的分離度大于1.5，三次連續(xù)進(jìn)樣的峰面積RSD不大于2%，系統(tǒng)適用性良好（表1、2）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

LPC在濃度20.56 ～411.12 mg/ml范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，線性方程為y=1.670 6x+2.352 5，R=0.999 8；LPE在濃度5.79～115.71 mg/ml范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，線性方程為y=1.657x+2.563 1，R=0.999 4。

2.3 檢測(cè)限和定量限

LPC和LPE的定量限濃度分別為23.1 mg/ml、10.3 mg/ml；LPC和LPE的檢測(cè)限濃度分別為9.2 mg/ml、4.1 mg/ml。

2.4 專屬性

加標(biāo)供試品溶液色譜圖顯示LPC和LPE峰與其它峰的分離度均大于1.5，該方法專屬性好（圖1）。

2.5 準(zhǔn)確度

經(jīng)計(jì)算，LPC和LPE的準(zhǔn)確度分別為93.4%～ 95.9%、92.4%～107.3%，均在90%～110%以內(nèi)，RSD均不大于10%，符合中國(guó)藥典有關(guān)規(guī)定[8]374-377（表3）。

2.6 精密度

2.6.1 系統(tǒng)精密度

LPC和LPE的峰面積RSD均不大于2%（表4）。

2.6.2 重復(fù)性

取0.04、0.1、0.2 mg/ml三個(gè)濃度的數(shù)據(jù)作線性，LPC線性方程為Y=1.670 4X+2.261 5，R=1；LPE線性方程為Y= 1.697X + 2.327 7，R=1。LPC含量的RSD為1.0%，不大于5%，LPE均未檢測(cè)出，符合要求（表5）。

2.7 耐用性

在不同流速、柱溫、流動(dòng)相比例條件下進(jìn)樣，系統(tǒng)適用性溶液的分離度均不小于1.5，各條件下供試品溶液的LPC含量RSD均不大于5%，LPE均未檢出。表明此方法耐用性良好（表6）。

2.8 溶液穩(wěn)定性

LPC和LPE濃度變化均不大于5%（表7）。表明對(duì)照品溶液在室溫和冷藏（2～8 ℃）條件下放置2 d，供試品溶液在室溫條件下放置2 d，不影響結(jié)果測(cè)定。

2.9 樣品中LPC和LPE的測(cè)定

3批樣品的LPC和LPE均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（表8）。

3 討論

本研究按照原研制劑丙泊酚中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液進(jìn)行仿制，初期依據(jù)進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)（JX20100226）僅對(duì)LPC進(jìn)行方法學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)重現(xiàn)性、耐用性、準(zhǔn)確度等較差，可能與儀器、色譜柱、溶劑、不同來(lái)源藥用輔料等因素相關(guān)，我們只對(duì)我公司特定生產(chǎn)工藝的產(chǎn)品及色譜條件進(jìn)行了方法學(xué)研究。卵磷脂是脂肪乳劑中引入LPC和LPE的主要途徑，丙泊酚脂肪乳注射液（征求意見稿）控制了LPC和LPE限度，故本產(chǎn)品仿制時(shí)結(jié)合了原研制劑（LPC≤2.0 mg/ml）和丙泊酚脂肪乳注射液（征求意見稿）（LPC≤2.0 mg/ml、LPE≤0.6 mg/ml）的要求，同時(shí)考慮本產(chǎn)品采用的卵磷脂為蛋黃卵磷脂（Lipoid GmbH），其在藥用輔料中的不同來(lái)源對(duì)含量的限值有影響[11]，制定了本產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（LPC≤1.5 mg/ml、LPE≤0.5 mg/ml），并進(jìn)行了仿制藥注冊(cè)申報(bào)。開發(fā)仿制藥不能局限于一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，尤其是特定雜質(zhì)、有關(guān)物質(zhì)等限量檢測(cè)項(xiàng)，可參考多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，來(lái)制定更嚴(yán)、更合理、更準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)，保障產(chǎn)品的安全和有效。

本研究參照丙泊酚乳狀注射液征求意見稿（第四版）中LPC和LPE的分析方法進(jìn)行了驗(yàn)證，在此基礎(chǔ)上，對(duì)諸如霧化氣壓力等儀器參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整后，可有效檢出丙泊酚中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液中卵磷脂的降解產(chǎn)物L(fēng)PC和LPE。LPC和LPE主要來(lái)源為輔料卵磷脂及高溫滅菌階段，產(chǎn)品未檢測(cè)出LPC，可能與本研究采用的精制蛋黃卵磷脂和經(jīng)驗(yàn)證的高溫滅菌工藝較為完備有關(guān)。本研究對(duì)照品溶液中LPC為分叉峰，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]，因此在產(chǎn)品檢測(cè)時(shí)需將與對(duì)照品對(duì)應(yīng)的分叉峰一起計(jì)入雜質(zhì)。通過研究，該方法專屬性、重復(fù)性及耐用性好，適合丙泊酚中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液的LPC和LPE控制，也可為各仿制該產(chǎn)品的企業(yè)提供數(shù)據(jù)支持。

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