付遠虹,吳 敏
(湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 手術室, 湖北 恩施 445000)
結腸癌(Colon cancer)是世界上最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率均較高[1]。一般認為,結腸癌的發(fā)病機制主要與癌基因的激活和抑癌基因的失活有關[2]。以往研究表明,信號傳導在結腸癌的病理過程和細胞存活中起著關鍵作用,通過調節(jié)局部免疫反應、炎癥反應和巨噬細胞功能參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[3]。膜聯(lián)蛋白A3(ANXA3)在腫瘤細胞的形成、增殖、凋亡和信號轉導中發(fā)揮重要作用;ANXA3表達水平的改變對腫瘤發(fā)生、發(fā)展、耐藥性和轉移有著重要的影響[4-5]。早期研究已提出,ANXA3在結腸癌細胞中高表達,并且還可作為診斷結腸癌的標志物[6-7],而其在結腸癌中的作用機制尚不清楚。尋找能夠治療結腸癌的藥物已迫在眉睫。目前,已證實較多中藥天然成分具有明顯的抗腫瘤活性,并且引起的不良反應較低,其中包括豆科植物的提取物。
黃芪多糖(RSP)提取于豆科草本植物黃芪,具有抗腫瘤的藥理活性[8]。RSP可通過抑制p38和JNK信號傳導,進而誘導腫瘤細胞凋亡[9]。另外,ANXA3沉默還可抑制其下游信號JNK和p38傳導,進而抑制腫瘤細胞增殖,誘導其凋亡[10-11]。因此,對ANXA3/JNK和p38信號傳導進行抑制,可能成為治療腫瘤的靶點。RSP對結腸炎具有顯著的改善作用[12],但是其對結腸癌的影響尚未見報道。因此,本研究探討RSP對人結腸癌HT-29細胞增殖和凋亡的作用,并觀察其對ANXA3/JNK和p38信號通路的影響。
1.1 主要藥品試劑 黃芪多糖(批號:C10297500)、HY-N0168(批號:MP50S)和MPT0B392(批號:RB392)均購自美國Sigma公司;Annexin V-FITC/PI(批號:KGA107)和CCK-8試劑盒(批號:WST-87)購自江蘇碧云天生物技術研究所;Caspase-glot-3/-9活性測定試劑盒(批號:C1157)購買于美國Promega公司;BrdU試劑盒(批號:ab126572)購自上海Roche Diagnostics公司;total-PARP(t-PARP,批號:ab0128098)、Cle-PARP(批號:ab1028765)、Cle-caspase 3(批號:ab0032786)、ANXA3(批號:ab1100938)、p-p38(批號:ab2102946)、p38(批號:ab1126094)、p-JNK(批號:ab1109847)、JNK(批號:ab0918274)和β-actin(批號:ab0012893)購自英國Abcam公司。
1.2 主要儀器 單人超凈臺(蘇州華新空調凈化有限公司);細胞培養(yǎng)箱(上海醫(yī)用分析儀器廠);Victor3 1420 Multilable Counter酶標儀(DX540,美國);SDS-PAGE凝膠電泳儀(型號DYCZ-24DN,北京六一儀器廠);成像系統(tǒng)(BIO-RAD,美國),F(xiàn)ACS-Calibur流式細胞儀(BD公司,美國)。
1.3 HT-29細胞培養(yǎng)與藥物干預 采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)箱條件設置為5%CO2、37 ℃恒溫,顯微鏡觀察細胞生長至90%左右時,便傳代培養(yǎng)進行后續(xù)實驗。待細胞處于對數(shù)生長期時,采用RSP(0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL)、p38激動劑HY-N0168(2 μg/mL)和JNK激動劑MPT0B392(0.5 μg/mL)處理細胞后,進行后續(xù)實驗。
1.4 ANXA3質粒轉染 ANXA3 mimics和ANXA3 inhibitor質粒由武漢巴菲爾生物有限公司合成,采用Lipofectamine 2000試劑轉染質粒至HT-29細胞,具體操作步驟嚴格按照說明書進行。將細胞分為4組:對照組、RSP組、RSP+ANXA3 mimics組和RSP+ANXA3 inhibitor組。
1.5 CCK-8實驗 將對數(shù)期HT-29細胞接種于96孔板,每孔1×104個細胞,培養(yǎng)過夜,然后加入0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL的RSP處理細胞24、48、72、96 h后,棄去舊培養(yǎng)液,每孔加入100 μL含10 μL的CCK-8試劑的DMEM培養(yǎng)液,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1.5 h,在酶標儀450 nm波長處檢測細胞吸光度OD值,并計算細胞相對活力。計算公式如下:細胞相對活力(%)=OD實驗組/OD對照組×100%。
1.6 細胞克隆數(shù)分析 將對數(shù)期HT-29細胞接種于6孔板,每孔1 000個細胞,培養(yǎng)過夜,然后加入0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL的RSP處理細胞6 d后,每2 天更換1次含RSP的新鮮培養(yǎng)液;然后對克隆細胞進行染色并計數(shù)。
1.7 BrdU ELISA實驗 將對數(shù)期HT-29細胞接種于96孔板,每孔1×104個細胞,培養(yǎng)過夜;0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL的RSP處理細胞48 h后,加入BrdU試劑孵育12 h;再采用ELISA試劑盒檢測BrdU偶聯(lián)的細胞,操作步驟嚴格按照說明書進行。最后在酶標儀405 nm處測定其吸光度OD值。
1.8 流式細胞術 收集各組細胞,PBS清洗2次,收集細胞,采用2.0 mg/mL的PI染液和RNase I染色30 min,流式細胞儀立即檢測細胞周期分布情況。另外,收集細胞,PBS重懸后,分別加入Annexin-V FITC和PI處理細胞(按照試劑盒操作說明書進行),最后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。
1.9 蛋白表達分析 收集各組細胞,每組加入200 μL的裂解液,置于冰上充分裂解30 min,4 ℃、12 000 rpm離心,收集上清。BCA法檢測了上清中總蛋白濃度,每孔上樣40 μg進行電泳分離,恒壓70 V,電泳3 h。然后在恒流275 mA條件下電轉70 min,5%脫脂牛奶封閉1 h后,將目的條帶放入對應的一抗溶液(稀釋比1∶1 000)中,4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜3次,每次10 min,再把條帶放入盛二抗(稀釋比1∶3 000)的平皿中室溫孵育1 h,TBST洗膜3次,每次10 min。加入4 mL的ECL顯影液顯色3 min,凝膠成像系統(tǒng)曝光。
1.10 Caspase活性試驗 收集各組細胞,采用Caspase-glot-3/-9活性測定試劑盒檢測Caspase-3/9活性,操作步驟嚴格按照說明書進行,酶標儀在405 nm處測定其吸光度值。
1.11 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,組間比較采用單因素方差分析檢驗,兩兩組間比較采用t檢驗,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
2.1 ASP降低HT-29細胞生長 與0 mg/mL的RSP組相比,不同濃度RSP處理細胞48、72、96 h后,細胞相對活力顯著降低,并表現(xiàn)出時間和濃度依賴性(P<0.05,見圖1A)。1.0、2.0、4.0 mg/mL的RSP干預HT-29細胞48 h后,細胞克隆數(shù)和BrdU ELISA吸光度值相比于0 mg/mL的RSP組顯著降低(P<0.05,見圖1B、C)。進一步對細胞周期分析發(fā)現(xiàn),RSP誘導G1期細胞數(shù)明顯增高,而S期和G2期細胞數(shù)則明顯減少(P<0.05,見圖1D)。
*:與0 mg/mL的RSP組或對照組比較,P<0.05。圖1 RSP抑制HT-29細胞增殖
2.2 RSP誘導HT-29細胞凋亡 0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL的RSP干預HT-29細胞48 h后,能降低抗凋亡蛋白t-PARP表達水平,誘導促凋亡蛋白Cle-PARP和Cle-caspase 3表達(見圖2A);Caspase-3和Caspase-9活性隨著RSP濃度升高而增強(見圖2B);與0 mg/mL的RSP組相比,1.0、2.0、4.0 mg/mL的RSP干預HT-29細胞48 h后,Histone DNA水平和細胞凋亡率顯著升高,表現(xiàn)出劑量依賴性(F=7.564,P<0.05,見圖2C、D)。
2.3 RSP抑制ANXA3/p38和JNK信號通路活化 與對照組相比,2 mg/mL的RSP處理HT-29細胞48 h后,其中ANXA3表達水平及p38和JNK磷酸化水平則顯著降低,差異比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05);然而,p38和JNK蛋白表達水平相比于對照組差異沒有顯著性(P>0.05,見圖3)。
*:與0 mg/mL的RSP組比較,P<0.05。圖2 RSP誘導HT-29細胞凋亡
*:與對照組比較,P<0.05。圖3 RSP對ANXA3/p38和JNK信號通路的影響
2.4 p38和JNK激動劑降低RSP對HT-29細胞生長的抑制作用 采用p38激動劑HY-N0168(2 μg/mL)和JNK激動劑MPT0B392(0.5 μg/mL)與RSP(2.0 mg/mL)共同處理HT-29細胞48 h后,發(fā)現(xiàn)RSP+HY-N0168和RSP+MPT0B392組細胞活力相對于單純RSP組明顯升高,而相比于對照組明顯降低(P<0.05,見圖4A);另外,RSP+HY-N0168和RSP+MPT0B392組細胞凋亡率相對于單純RSP組明顯降低,而相比于對照組明顯升高(P<0.05,見圖4B)。提示HY-N0168和MPT0B392能部分逆轉RSP對HT-29細胞增殖的抑制作用。
*:與對照組比較,P<0.05;#:與RSP組比較,P<0.05。圖4 HY-N0168和MPT0B392對HT-29細胞增殖和凋亡的影響
2.5 ANXA3沉默和過表達改變RSP對HT-29細胞的影響 ANXA3 mimics和ANXA3 inhibitor質粒轉染HT-29細胞,ANXA3 mimics能明顯誘導ANXA3蛋白過表達,而ANXA3 inhibitor則顯著沉默ANXA3蛋白表達(見圖5A、B)。相比于單純RSP組,RSP+ANXA3 mimics組p-p38和p-JNK表達水平明顯升高,細胞活力明顯升高,細胞凋亡率顯著降低(P<0.05);RSP+ANXA3 inhibitor組p-p38和p-JNK表達水平明顯降低,細胞活力明顯降低,細胞凋亡率顯著增高(P<0.05)。相比于對照組,RSP+ANXA3 mimics組p-p38和p-JNK表達水平明顯降低,細胞活力明顯降低,細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);RSP+ANXA3 inhibitor組p-p38和p-JNK表達水平明顯降低,細胞活力明顯降低,細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。
*:與對照組比較,P<0.05;#:與RSP組比較,P<0.05。圖5 RSP通過ANXA3調節(jié)HT-29細胞生長
膜聯(lián)蛋白(Annexins)是一種結構相關的鈣依賴性磷脂結合蛋白,約占細胞總蛋白的2%[13]。膜聯(lián)蛋白參與了膜輸送和膜表面發(fā)生的一系列鈣調素依賴性活動,包括囊泡的運輸、胞吐過程中的膜融合、信號轉導和鈣通道的形成;另外,還可以調節(jié)炎癥反應、細胞分化和細胞骨架蛋白之間的相互作用。膜聯(lián)蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,可介導細胞信號通路、細胞運動、腫瘤侵襲轉移、血管生成、細胞凋亡和耐藥性等[14]。
Annexins A3(ANXA3)是膜聯(lián)蛋白超家族成員,ANXA3基因位于染色體4q13-q22上,蛋白質由323個氨基酸殘基組成[15]。ANXA3表達水平的變化可能對腫瘤的發(fā)生發(fā)展、耐藥性和轉移有重要影響。研究表明,ANXA3在胰腺和大腸癌組織中的表達明顯高于良性組織,在前列腺癌組織中的表達明顯低于良性前列腺組織[16]。這些發(fā)現(xiàn)表明,ANXA3可以作為一個潛在的腫瘤診斷、治療和預后的生物標志物。另外,p38和JNK信號分子與結腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關,它們主要參與細胞增殖、遷移、分化、凋亡及炎癥[17]。研究發(fā)現(xiàn)ANXA3可通過激活肝癌干細胞中JNK信號通路活化,進而促進腫瘤的形成[18];ANXA3沉默還可抑制其下游信號p38傳導,進而誘導腫瘤細胞凋亡[11]。
RSP具有較強的抗腫瘤活性,但對結腸癌的相關研究較少。本文實驗結果提示,RSP能抑制HT-29細胞增殖、誘導其凋亡。對其作用機制研究發(fā)現(xiàn),RSP降低抗凋亡蛋白t-PARP表達、誘導促凋亡蛋白Cle-PARP和Cle-caspase3表達,還降低了Caspase-3/9活性,最終阻滯HT-29細胞生長,促使其凋亡發(fā)生。早期也有研究提示,RSP可通過誘導Caspase-3和Caspase-9蛋白表達,促使肝癌細胞凋亡[19]。既往研究提出,RSP可通過抑制JNK信號傳導起著抗炎的作用,還可通過抑制p38降低caspase依賴的細胞凋亡[9]。本文發(fā)現(xiàn),RSP可抑制HT-29細胞中p38和JNK磷酸化,發(fā)揮抗結腸癌的藥理活性。本實驗進一步采用p38激動劑、JNK激動劑與RSP共同干預HT-29細胞,發(fā)現(xiàn)它們可以部分逆轉RSP對細胞增殖的抑制作用及對細胞凋亡的誘導作用,說明RSP可通過p38和JNK信號通路調節(jié)結腸癌細胞生長。
ANXA3作為p38和JNK的正向調節(jié)子,其高表達可降低RSP對p38和JNK磷酸化的抑制作用;對ANXA3進行沉默可增強RSP對p38和JNK磷酸化的抑制作用。說明RSP通過抑制ANXA3表達,進而降低p38和JNK信號傳導。ANXA3過表達還可部分逆轉RSP對HT-29細胞增殖的抑制作用,導致其凋亡的降低;ANXA3沉默則促進RSP對細胞增殖的抑制作用,導致其凋亡的增高。
綜上所述,RSP可通過抑制ANXA3/p38和JNK信號通路誘導結腸癌細胞的凋亡,為結腸癌的治療提供了新思路。