盧 童，徐 康

(1.湖北省天門市第一人民醫(yī)院 泌尿外科，湖北 天門 431700；2.武漢科技大學(xué) 職業(yè)危害識(shí)別與控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430081)

膀胱腫瘤是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[1]，其中以移行細(xì)胞癌最為常見。多數(shù)膀胱腫瘤患者需接受膀胱內(nèi)灌注化療，以期降低膀胱腫瘤復(fù)發(fā)機(jī)會(huì)。吉西他濱(Gemcitabine，Gem)是一類胞嘧啶核苷衍生物，主要作用于細(xì)胞周期的S期，通過干擾DNA復(fù)制發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，目前常用于膀胱灌注化療[2-3]。但是在使用了一定治療周期此類藥物后，膀胱腫瘤細(xì)胞對(duì)其化療敏感性會(huì)逐漸下降。c-Myc是Myc家族的重要成員，是一類重要的原癌基因，在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)[4-6]，近期部分研究提示抑制c-Myc表達(dá)可提高胰腺癌和骨肉瘤等惡性腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性[7-8]。基于上述研究背景，本研究擬采用小干擾RNA靶向下調(diào)c-Myc在膀胱腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，檢測其與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用對(duì)化療效果的影響，并初步探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 免疫組化 選取27例膀胱移行細(xì)胞癌組織及22例癌旁組織，按以下基本步驟行免疫組化檢測：所有標(biāo)本經(jīng)固定包埋后制成5 μm切片，經(jīng)脫蠟入水，阻斷和抗原修復(fù)后，使用c-Myc一抗(CST公司)于1∶200濃度、4℃條件下孵育過夜，洗脫后，使用HRP標(biāo)記的二抗(博士德生物公司)于1∶1 000濃度、室溫條件下孵育20 min，隨后顯色并拍照，經(jīng)圖像分析系統(tǒng)檢測獲得c-Myc在各個(gè)組織中表達(dá)的平均光密度值。

1.2 小干擾RNA合成 本研究中針對(duì)c-Myc序列設(shè)計(jì)合成一組小干擾RNA(si-c-Myc)，正義鏈序列(5’-3’)：GGUCAGAGUCUGGAUCACC，反義鏈序列(5’-3’)：GGUGAUCCAGACUCUGACC。同時(shí)設(shè)計(jì)合成一組不結(jié)合任何人類基因組的陰性對(duì)照小RNA。本研究采用的小干擾RNA均由Thermo Fisher公司設(shè)計(jì)合成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 本研究采用了人類膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞株SW780，在含有10%血清的DMEM中培養(yǎng)，研究中將細(xì)胞分為5組：空白組不加入任何藥物及小RNA，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照小RNA，si-c-Myc組轉(zhuǎn)染si-c-Myc，Gem組加入吉西他濱(江蘇豪森公司)處理(藥物終濃度0.05g/L)，si-c-Myc+Gem組轉(zhuǎn)染si-c-Myc并加入吉西他濱處理(藥物終濃度0.05g/L)。

1.4 小RNA轉(zhuǎn)染 本研究采用了陽離子聚合物 INTERFER in vitro siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒(Polyplus公司)，按操作規(guī)程進(jìn)行小RNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染過程中使用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率，其中陰性對(duì)照組、si-c-Myc組及si-c-Myc+Gem組的轉(zhuǎn)染濃度均為25 nM。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)凋亡率檢測 將上述各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)藥物及小RNA轉(zhuǎn)染處理48 h后，收獲細(xì)胞并重懸，加入Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑(Beyotime公司)標(biāo)記，隨后將各組細(xì)胞置于流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

1.6 Western blot免疫印跡檢測 上述各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)藥物及小RNA轉(zhuǎn)染處理48 h后，收獲細(xì)胞并裂解獲得蛋白后測定蛋白濃度，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟處理，隨后以一抗孵育過夜，經(jīng)洗脫后再以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育，相應(yīng)蛋白條帶經(jīng)顯影后拍照。本研究中使用了以下一抗：anti-c-Myc抗體(CST公司)，anti- caspase 9 pro抗體(Abcam公司)、anti- caspase 3 pro抗體(Proteintech公司)、anti-Bcl-2抗體(Abcam公司)和anti-Bax抗體(Abcam公司)，內(nèi)參使用anti-β-actin抗體(Santa Cruz公司)。

2 結(jié)果

2.1 c-Myc在膀胱腫瘤組織中呈高表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，c-Myc蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色顆粒樣著色，如圖1所示，c-Myc在膀胱移行細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯強(qiáng)于癌旁組織。圖像分析系統(tǒng)檢測光密度值顯示，c-Myc在移行細(xì)胞癌組織中表達(dá)的平均光密度值為0.55±0.02，癌旁組織中表達(dá)的平均光密度值為0.22±0.01，兩組間光密度值有明顯差異(P<0.01)。

A: c-Myc在癌旁組織的表達(dá)；B：c-Myc在膀胱腫瘤組織的表達(dá)；×200。 圖1 免疫組化法檢測c-Myc在膀胱腫瘤組織及癌旁組織的表達(dá)

2.2 小干擾RNA si-c-Myc可有效抑制c-Myc在SW780細(xì)胞中的表達(dá) 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，小干擾RNA對(duì)SW780細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為(70.4±3.1)%。Western blot檢測結(jié)果如圖2所示，與未轉(zhuǎn)染si-c-Myc的空白組和Gem組以及轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照小RNA的陰性對(duì)照組相比，經(jīng)si-c-Myc轉(zhuǎn)染處理48h后的si-c-Myc組和si-c-Myc+Gem組SW780細(xì)胞內(nèi)c-Myc蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。

2.3 聯(lián)合應(yīng)用si-c-Myc和吉西他濱可明顯提高SW780細(xì)胞凋亡率 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示，空白組、陰性對(duì)照組、si-c-Myc組、Gem組、si-c-Myc+Gem組的SW780細(xì)胞凋亡率依次為：(5.41±0.52)%、(6.19±0.41)%、(12.88±0.86)%、(14.94±0.63)%、(30.38±1.06)%。如圖3所示，si-c-Myc組和Gem組細(xì)胞凋亡率明顯高于空白組和陰性對(duì)照組(P<0.01)，而si-c-Myc+Gem組的細(xì)胞凋亡率則明顯高于si-c-Myc組和Gem組(P<0.01)。

*：與空白組、陰性對(duì)照組和Gem組相比，P<0.05。 圖2 Western blot檢測各組SW780細(xì)胞c-Myc蛋白的表達(dá)

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組SW780細(xì)胞的凋亡率

2.4 聯(lián)合應(yīng)用si-c-Myc和吉西他濱可影響SW780細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 如圖4所示，與空白組和陰性對(duì)照組相比，si-c-Myc組和Gem組的SW780細(xì)胞內(nèi)的caspase 9 pro蛋白、caspase 3 pro蛋白和Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)則明顯上調(diào)(P<0.05)。而與si-c-Myc組和Gem組相比，si-c-Myc+Gem組的caspase 9 pro蛋白、caspase 3 pro蛋白和Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，而Bax蛋白表達(dá)則明顯上調(diào)(P<0.05)。

*：與空白組和陰性對(duì)照組相比，P<0.05；#：與si-c-Myc組和Gem組相比，P<0.05。圖4 Western blot檢測各組SW780細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

作為膀胱腫瘤術(shù)后灌注化療的常用藥物，吉西他濱可在細(xì)胞周期過程中發(fā)揮特異性作用，將腫瘤細(xì)胞抑制并殺滅在DNA合成期(S期)，從而阻斷腫瘤的進(jìn)展[9-10]。作為一種具有多次復(fù)發(fā)傾向的腫瘤，膀胱腫瘤在接受多次灌注化療后，對(duì)化療藥物的敏感性往往會(huì)逐漸下降，從而影響治療效果。目前，腫瘤靶向治療聯(lián)合化療藥物是一類較為常見的應(yīng)對(duì)化療藥物敏感降低的策略，而尋找合適的治療靶點(diǎn)則成為目前膀胱腫瘤治療的研究熱點(diǎn)[11-12]。

作為MYC家族的成員，c-Myc是一種重要的原癌基因，可在多種人類腫瘤組織中過表達(dá)并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的作用：c-Myc基因定位于第8號(hào)染色體，其羧基端含有b-HLH-Zip結(jié)構(gòu)域，可與Max的同類結(jié)構(gòu)域相結(jié)合形成二聚體，此類二聚體可以與帶有E盒的啟動(dòng)子相結(jié)合并啟動(dòng)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄過程[13]。目前的多項(xiàng)研究顯示，c-Myc在多種實(shí)體腫瘤中呈高表達(dá)，并有顯著的促進(jìn)腫瘤增殖或遷移的效應(yīng)[14-15]。本研究中采用免疫組化方法檢測了膀胱移行細(xì)胞癌和癌旁組織中的c-Myc表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中c-Myc蛋白的表達(dá)明顯高于癌旁組織，提示c-Myc可能在膀胱腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中也起到重要作用。

近期的多項(xiàng)研究表明，c-Myc可作為一種重要的腫瘤治療靶點(diǎn)[16-17]，靶向下調(diào)c-Myc表達(dá)或使用c-Myc抑制劑可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[18-19]、抑制腫瘤增殖[20]或增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性[7-8]。為此，本研究中進(jìn)一步針對(duì)c-Myc的mRNA序列合成了小干擾RNA si-c-Myc，并將其導(dǎo)入SW780膀胱腫瘤細(xì)胞內(nèi)，結(jié)果表明此類小干擾RNA可有效的靶向性抑制c-Myc蛋白在膀胱腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。隨后的研究中，聯(lián)合應(yīng)用si-c-Myc和吉西他濱干預(yù)SW780細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)應(yīng)用吉西他濱干預(yù)膀胱腫瘤細(xì)胞相比，將si-c-Myc與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)一步促進(jìn)膀胱腫瘤細(xì)胞凋亡，這一結(jié)果表明靶向抑制c-Myc表達(dá)與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用可有效增強(qiáng)膀胱腫瘤細(xì)胞的化療敏感性。

為進(jìn)一步探討聯(lián)合應(yīng)用si-c-Myc和吉西他濱誘導(dǎo)膀胱腫瘤細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，本研究中采用Western blot法檢測了各組膀胱腫瘤細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，將si-c-Myc與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用明顯放大了凋亡調(diào)控因子caspase 9蛋白的激活效應(yīng)，并激活了重要的細(xì)胞凋亡效應(yīng)蛋白caspase 3，同時(shí)進(jìn)一步增強(qiáng)了下調(diào)Bcl-2及上調(diào)Bax表達(dá)的效應(yīng)，引起B(yǎng)cl-2/Bax比例更加明顯的下調(diào)。由于Bcl-2/Bax比例的進(jìn)一步下調(diào)可引起線粒體內(nèi)膜的細(xì)胞色素C大量進(jìn)入胞漿，與凋亡蛋白酶活化因子1單體結(jié)合形成凋亡體復(fù)合體[21]，從而導(dǎo)致膀胱腫瘤細(xì)胞凋亡水平的進(jìn)一步上升，這可能是si-c-Myc與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)的機(jī)制之一。

綜上所述，c-Myc在膀胱腫瘤組織中呈高表達(dá)，si-c-Myc與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用可有效增強(qiáng)膀胱腫瘤細(xì)胞的化療敏感性，此方法可以作為膀胱腫瘤治療的一種新思路進(jìn)一步加以研究和探索。