孔繼昌 王恩艷 張巍 戴坤鵬 劉少云 付永杰 郭志強(qiáng)

近年來，老年人群中CHD、腦血管意外等心腦血管疾病發(fā)病率越來越高，已經(jīng)成為威脅人類健康最嚴(yán)重的疾病之一，其中動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）被認(rèn)為是心腦血管疾病重要的病理基礎(chǔ)和直接誘因［1］。AS 能夠廣泛侵襲全身血管，造成器官損傷，引起多種疾病的發(fā)生。血管內(nèi)皮細(xì)胞作為機(jī)體重要的代謝和內(nèi)分泌器官，其結(jié)構(gòu)及細(xì)胞功能受損在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。多篇文獻(xiàn)報(bào)道，腦源性生長因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）參與調(diào)節(jié)多種內(nèi)皮細(xì)胞的生長及分化，作為一種新的促血管新生因子，其能夠促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的血管新生［2］。最近有研究發(fā)現(xiàn)，在T2DM 合并頸動脈粥樣硬化病人的血清中，BDNF水平降低，暗示血清低水平的BDNF 可能參與頸動脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展［3］。因此，本研究以人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞（human coronary artery endothelial cells，HCAEC）為實(shí)驗(yàn)對象，探討B(tài)DNF對HCAEC功能的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 HCAEC 系購自中科院上海細(xì)胞庫；重組人源BDNF 蛋白購自ProSpec 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)液購自HYCLONE 公司；胎牛血清、雙抗和0.25%胰酶消化液購自Gibco 公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting Kit-8，CCK8）購自北京索萊寶公司；兔抗人蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化Akt（Phospho-Akt，p-Akt）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、磷酸化mTOR（Phospho-mTOR，p-mTOR）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK1/2）、磷酸化ERK1/2（Phospho-ERK1/2，p-ERK1/2）、Wnt 蛋白家族1（Wnt family member 1，Wnt1）、跨膜受體卷曲蛋白1（Frizzled1）、胞漿調(diào)節(jié)散亂蛋白1（dishevelled segment polarity protein 1 pseudogene 1，Dsh）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的抗兔IgG 抗體均購自Abcam 公司；細(xì)胞培養(yǎng)耗材均購自美國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理：HCAEC 置于含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（0.1 mg/mL）的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取生長狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為2 組，實(shí)驗(yàn)組加BDNF（50 ng/μL），對照組不做其他處理。

1.2.2 CCK8增殖實(shí)驗(yàn)：2組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，取100μL細(xì)胞懸液，以每孔1×103個(gè)/mL 細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)接種到96 孔板中，每隔24 h檢測1 次細(xì)胞活力，共檢測4 次，檢測前每孔加10μL CCK8 試劑，37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，使用酶標(biāo)儀用450 nm激發(fā)光檢測OD值，繪制增殖曲線。

1.2.3 平板單克隆形成實(shí)驗(yàn)：2 組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞10 min，用RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化，制備細(xì)胞懸液，按照2×103個(gè)/mL 細(xì)胞數(shù)接種到100 mm 培養(yǎng)皿中，實(shí)驗(yàn)組加入含BDNF（50 ng/μL）的RPMI-1640 培養(yǎng)液，對照組加入等量的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，3 d后更換培養(yǎng)液，再培養(yǎng)2 d，4%甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下觀察、拍照、計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)方法為：顯微鏡下任意選取5 個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)單克隆數(shù)目，取5 個(gè)視野的平均數(shù)為最后結(jié)果。

1.2.4 免疫印跡（Western blot）實(shí)驗(yàn)檢測信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平：2 組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，加RIPA 裂解液（使用前加入蛋白酶抑制劑）裂解提取蛋白，取適量蛋白液適度稀釋，通過BCA 法測定濃度，剩余蛋白液加入LDS sample buffer 煮沸5 min。配制10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠，20μg/孔加入蛋白樣品，轉(zhuǎn)膜至硝化纖維素膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，快速沖洗掉一抗，TBST 緩沖液洗3 次，每次5 min，二抗室溫孵育1 h，TBST 緩沖液洗3 次，每次5 min，加ECL 顯色。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。采用Image J 分析所得圖像，以目的蛋白/GAPDH灰度比值表示目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組HCAEC 增值能力比較 CCK8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h 后，2 組細(xì)胞OD 值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；培養(yǎng)48、72 h后，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞OD值均顯著增加（P均＜0.05）。見表1。

表1 2組細(xì)胞增殖能力比較（±s，n=3）

表1 2組細(xì)胞增殖能力比較（±s，n=3）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

72 h 0.8043±0.0573 1.1389±0.0747**組別對照組實(shí)驗(yàn)組0 h 0.2440±0.0415 0.2470±0.0101 24 h 0.3800±0.0330 0.4521±0.0441 48 h 0.5520±0.0671 0.7134±0.0638*

2.2 2組HCAEC 克隆形成能力比較 單克隆平板形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)5 d后，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞克隆形成數(shù)目為（228±13）個(gè)，與對照組相比［（85±7）個(gè)］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.776，P＜0.05）。

2.3 2 組PI3K/Akt/mTOR 信號通路蛋白表達(dá)水平比較 Western blot 結(jié)果表明，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的PI3K/Akt/mTOR 信號通路關(guān)鍵組分Akt 和mTOR 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），但p-Akt、p-mTOR 水平較對照組顯著增加（P均＜0.05）見表2。

表2 PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達(dá)水平（±s，n=3）

表2 PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達(dá)水平（±s，n=3）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

p-mTOR 0.413±0.069 0.584±0.059*組別對照組實(shí)驗(yàn)組Akt 0.767±0.082 0.704±0.043 p-Akt 0.469±0.046 0.903±0.075**mTOR 0.734±0.059 0.769±0.069

2.4 2 組ERK 信號通路蛋白表達(dá)水平比較 Western blot 結(jié)果表明，2 組細(xì)胞中的ERK 信號通路關(guān)鍵組分ERK1/2 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（0.609±0.032）比（0.587±0.044），t=0.7179，P=0.5125］；而實(shí)驗(yàn)組p-ERK1/2 表達(dá)水平較對照組顯著升高［（0.377±0.022）比（0.547±0.051），t= 5.3766，P=0.0058］。

2.5 2 組Wnt/β-catenin 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 Western blot 結(jié)果表明，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組Wnt/β-catenin 信 號 通 路 相 關(guān) 蛋 白Wnt1、Frizzled1 和Dsh的蛋白表達(dá)水平均顯著增加（P＜0.01）。見表3。

表3 2組Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=3）

表3 2組Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=3）

注：與對照組比較，**P ＜0.01

Dsh 0.339±0.043 0.690±0.041**組別對照組BDNF組Wnt1 0.086±0.060 0.364±0.053**Frizzled1 0.701±0.029 1.125±0.081**

3 討論

研究表明，BDNF在神經(jīng)細(xì)胞的生長發(fā)育、分化和再生、損傷修復(fù)等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4-5］。Guan等［6］研究發(fā)現(xiàn)，BDNF 在腦出血后表達(dá)上調(diào)，能夠促進(jìn)神經(jīng)再生和血管生成。目前，BDNF 已經(jīng)表現(xiàn)出了對PD［7］、AD［8］等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療潛力。另有研究表明，BDNF 在HUVECs 和人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種內(nèi)皮細(xì)胞以及新生血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，參與維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活［9］，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移并抑制細(xì)胞衰老和凋亡，促進(jìn)血管新生［10］。但目前尚無BDNF 對HCAEC 功能的影響及其作用機(jī)制的相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，外源添加BDNF 處理可明顯促進(jìn)HCAEC 的增殖和克隆能力，與在HUVECs 中發(fā)揮的功能類似。然而，BDNF 調(diào)節(jié)HCAEC 增殖和克隆能力的具體分子機(jī)制和所涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還尚未清楚。

PI3K/Akt/mTOR 信號通路是生物體內(nèi)關(guān)鍵的信號通路，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、存活和凋亡等生理活動［11］。在HUVECs 中，BDNF 就是通過PI3K/Akt 信號傳導(dǎo)通路促進(jìn)HUVECs 的體外遷移和存活［2］。本研究發(fā)現(xiàn)，BDNF 處理增加了Akt 和m-TOR 蛋白的磷酸化水平，促進(jìn)了PI3K/Akt/mTOR 信號通路的活化，提示PI3K/Akt/mTOR 信號通路可能參與了BDNF誘導(dǎo)的HCAEC增殖和克隆。ERK1/2是一個(gè)能夠介導(dǎo)血管新生的重要的信號蛋白，在HUVECs 中，ERK1/2 被BDNF 誘導(dǎo)磷酸化，參與了HUVECs 細(xì)胞增殖［2］。本研究發(fā)現(xiàn)，BDNF 處理同樣增加了HCAEC 中ERK1/2蛋白的磷酸化水平，因此，ERK 信號通路也可能參與了BDNF促進(jìn)HCAEC增殖的過程。

Wnt/β-catenin 信號通路也是一條生物發(fā)育、細(xì)胞增殖和凋亡等生理活動的關(guān)鍵信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin 信號通路參與了BDNF 誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)元干細(xì)胞生長的過程［12-13］。因此，本研究分析了HCAEC 中BDNF與Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)系。結(jié)果表明，BDNF 處理組細(xì)胞中的Wnt/β-catenin 信號通路相關(guān)蛋白Wnt1、Frizzled1 和Dsh 的表達(dá)水平升高，提示W(wǎng)nt/β-catenin 信號通路可能也參與了BNDF誘導(dǎo)的HCAEC 增殖和克隆過程。那PI3K/Akt/mTOR信號通路、ERK 信號通路和Wnt/β-catenin 信號通路具體是如何參與BDNF 對HCAEC 增殖和克隆的誘導(dǎo)過程的呢？這三條信號通路是否有相互聯(lián)系？這將是我們下一步深入研究的重點(diǎn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)BDNF 能夠誘導(dǎo)HCAEC的增殖和克隆，可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR 信號通路、ERK 信號通路和Wnt/β-catenin 信號通路發(fā)揮作用。本研究揭示了BDNF 在HCAEC 生長過程中具有重要意義，為將來BDNF在AS臨床治療中的應(yīng)用提供了參考。