譚慧林 金永生 吳忠紅

摘 要：通過(guò)參加水中銅綠假單胞菌能力驗(yàn)證，提高實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)?zāi)芰?，總結(jié)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的關(guān)鍵點(diǎn)控制，討論應(yīng)用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 8538-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》檢驗(yàn)銅綠假單胞菌存在的問(wèn)題。

關(guān)鍵詞：銅綠簡(jiǎn)單胞菌;國(guó)家標(biāo)準(zhǔn);檢驗(yàn);關(guān)鍵點(diǎn)

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種常見的條件致病菌，水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道都有此菌存在。此菌喜歡潮濕的環(huán)境。食品中主要在飲用水中存在，人飲用含有銅綠假單胞菌污染的飲用水后會(huì)導(dǎo)致食源性疾病，對(duì)免疫力低下或喪失免疫力的患者來(lái)說(shuō)具有較高的致病風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)，包裝飲用水憑借飲用方便、水質(zhì)潔凈等優(yōu)勢(shì)，迅速進(jìn)入了家庭及辦公場(chǎng)所，國(guó)內(nèi)外關(guān)于包裝飲用水受銅綠假單胞菌污染的報(bào)道也日漸增多[1]。所以應(yīng)加強(qiáng)對(duì)包裝飲用水中銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)，而檢驗(yàn)準(zhǔn)確是保證食品安全的有力手段。

能力驗(yàn)證是利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)來(lái)確定實(shí)驗(yàn)檢測(cè)能力的活動(dòng)，是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的重要手段。它是確保實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性和提高檢測(cè)水平的重要手段。為提高本中心微生物室檢驗(yàn)?zāi)芰?，增?qiáng)本中心市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，本中心微生物室參加了中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心組織的礦泉水中銅綠假單胞菌的檢測(cè)能力驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)室采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 8538-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》進(jìn)行檢驗(yàn)。通過(guò)本次能力驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 8538-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》存在的描述問(wèn)題，提出解決方案，為準(zhǔn)確計(jì)數(shù)銅綠假單胞菌提出操作指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

樣品由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心提供（編號(hào)為19-P370、19-Q883）;銅綠假單胞菌（ATCC 27853）購(gòu)自環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 試劑

假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（CN）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、氧化酶試紙、乙酰胺肉湯、鈉氏試劑、綠膿菌素測(cè)定培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）;0.45 μm濾膜與濾杯（環(huán)凱）。

1.3 儀器

生化培養(yǎng)箱（美墨爾特）;多聯(lián)過(guò)濾系統(tǒng)（環(huán)凱微生物科技有限公司）;高壓滅菌器（施都凱儀器設(shè)備公司）暗箱式自動(dòng)紫外分析儀（上海市安亭電子儀器廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品處理

根據(jù)ASAC-PT551（2018）礦泉水中銅綠假單胞菌的檢測(cè)能力驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書處理樣品，在生物安全柜中打開西林瓶，從已滅菌的520 mL無(wú)菌水中吸取5 mL無(wú)菌水，溶解西林瓶中的樣品，將西林瓶中的水靠近火焰傾注到無(wú)菌的1 000 mL三角瓶中，重復(fù)此操作3次，同時(shí)用移液槍吸取5 mL無(wú)菌水沖洗西林瓶蓋于無(wú)菌的

1 000 mL三角瓶中，最后將剩余的無(wú)菌水全部?jī)A注到無(wú)菌的1 000 mL三角瓶中，能力驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書稱此溶液為原液。從原液中吸取25 mL置于225 mL無(wú)菌水，渦旋1 min，此溶液為1∶10稀釋液，從稀釋液中吸取25 mL置于225 mL無(wú)菌水中，渦旋

1 min，此溶液為1∶100稀釋液。在日常實(shí)驗(yàn)中，銅綠假單胞菌污染程度比較嚴(yán)重，CN板上比較多，不容易準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，所以選取3個(gè)濃度檢測(cè)此次能力驗(yàn)證樣品中的銅綠假單胞菌[2]。

2.2 樣品過(guò)濾與培養(yǎng)

在過(guò)濾泵頭放置無(wú)菌的0.45 μm的濾膜，光面朝上，取250 mL原液、1∶10稀釋液、1∶100稀釋液加入到250 mL的濾杯中真空隔膜泵過(guò)濾，過(guò)濾杯中的待測(cè)液和稀釋液全部過(guò)濾后，用無(wú)菌水沖洗過(guò)濾杯3次，將過(guò)濾后的濾膜貼平鋪在CN瓊脂平皿上，正面朝上且不能有氣泡。將貼好濾膜的CN瓊脂平皿倒置放入到36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 觀察

培養(yǎng)24 h后觀察培養(yǎng)基，記錄菌落形態(tài)，24 h后培養(yǎng)基上有菌落長(zhǎng)出，計(jì)數(shù)菌落。再培養(yǎng)24 h，記錄菌落形態(tài)，發(fā)現(xiàn)此時(shí)許多菌落開始生長(zhǎng)，有的已經(jīng)連在一起，有的菌落此時(shí)產(chǎn)綠膿，菌落顏色為綠色，有的菌落為無(wú)色、乳白色、淡綠色或黃色。

2.4 可以菌落的驗(yàn)證

每個(gè)平板挑取在紫外燈下產(chǎn)熒光的菌落10個(gè)，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上純化培養(yǎng)18 h，做氧化酶實(shí)驗(yàn)，同時(shí)接種到乙酰胺肉湯中在36 ℃西安培養(yǎng)24 h后，添加2滴納氏試劑后觀察乙酰胺肉湯管中顏色變化（顏色由深黃色到磚紅色則為陽(yáng)性，其余為陰性）。綠色的菌落接種到綠膿菌素測(cè)定培養(yǎng)基中在

36 ℃下培養(yǎng)24 h，加入三氯甲烷

3～5 mL，三氯甲烷呈粉紅色到紫紅色。選取的產(chǎn)熒光的20個(gè)菌落氧化酶為陽(yáng)性，乙酰胺肉湯為陽(yáng)性，綠膿菌素為陽(yáng)性。

3 結(jié)果

通過(guò)在CN培養(yǎng)基上在36 ℃下培養(yǎng)24 h計(jì)數(shù)所有產(chǎn)熒光的菌落，48 h后再次記錄產(chǎn)綠和產(chǎn)熒光的菌落，選擇產(chǎn)熒光的菌落進(jìn)行氧化酶實(shí)驗(yàn)、乙酰胺肉湯實(shí)驗(yàn)，對(duì)產(chǎn)綠膿的菌進(jìn)行綠膿菌素驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)報(bào)出此次能力驗(yàn)證結(jié)果19-P370為21 000 CFU/250 mL，19-Q883為19 000 CFU/250 mL。19-P370的Z值為0.6，19-Q883 Z值為0.8，能力驗(yàn)證結(jié)果為滿意。

4 討論

能力驗(yàn)證是實(shí)驗(yàn)室外部質(zhì)控的手段之一，通過(guò)參加能力驗(yàn)證可提高檢驗(yàn)員的檢驗(yàn)水平和實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)?zāi)芰?。本中心此次能力?yàn)證結(jié)果為滿意。通過(guò)參加能力驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB8538-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》檢驗(yàn)銅綠假單胞菌中存在的問(wèn)題，總結(jié)檢驗(yàn)銅綠假單胞菌的關(guān)鍵點(diǎn)，指導(dǎo)日常實(shí)驗(yàn)工作。

（1）國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中檢驗(yàn)水中銅綠假單胞菌時(shí)沒有要求稀釋樣品，在日常檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，檢驗(yàn)污染較嚴(yán)重的水時(shí)，銅綠假單胞菌在過(guò)濾膜上生長(zhǎng)的很多，無(wú)法計(jì)數(shù)，應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行稀釋，是從25 mL稀釋到225 mL。

（2）乙酰胺肉湯的判讀，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中銅綠假單胞菌在乙酰胺肉湯中培養(yǎng)24 h后，加入納氏試劑后，顏色由深黃色到磚紅色。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)空白乙酰胺肉湯加入納氏試劑后最終也能變?yōu)榇u紅色。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)水中存在銅綠假單胞菌時(shí)，只要加入納氏試劑立即就會(huì)變?yōu)榇u紅色。

（3）國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求菌落為綠色時(shí)，需要做綠膿素測(cè)定實(shí)驗(yàn)，在日常實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在CN上綠色的菌，綠膿菌素均為陽(yáng)性。

（4）可疑菌的純化生化鑒定。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求盡可能將所有經(jīng)濾膜過(guò)濾后的可疑菌落在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上純化培養(yǎng)后進(jìn)行生化鑒定。如果水污染嚴(yán)重，進(jìn)行純化鑒定的工作量非常大，且沒有必要。本中心參照GB4789.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》第二法中大腸菌群的生化鑒定：挑取10個(gè)可疑菌落進(jìn)行生化分析，根據(jù)比例計(jì)算銅綠假單胞菌個(gè)數(shù)。

（5）CN培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h時(shí)需要記錄產(chǎn)熒光的菌落，日常實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)銅綠簡(jiǎn)單胞菌在CN培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后可以產(chǎn)熒光，但產(chǎn)生綠膿素需要48 h，但CN培養(yǎng)48 h，銅綠假單胞菌會(huì)變大，菌落之間會(huì)粘連，不易計(jì)數(shù)。本中心在實(shí)驗(yàn)中選擇24 h計(jì)數(shù)一次，48 h計(jì)數(shù)一次，觀察產(chǎn)綠膿情況。

參考文獻(xiàn)

[1]蘇粉良，徐振東，陳雨欣.蘇州市包裝飲用水中銅綠假單胞菌污染調(diào)查[J].江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，2019，5（30）：326-327.

[2]王燕梅，唐震，喬昕，等.江蘇省桶裝飲用水中銅綠假單胞菌污染情況調(diào)查[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2015，25（12）：2019-2020.