錢 余，周恩譜，黃進寶，盧 濤

(1.上海市控江醫(yī)院泌尿外科，上海 200093；2.上海中醫(yī)藥大學教學實驗中心，上海 201203)

建立大鼠膀胱炎動物模型對研發(fā)各種生化藥、中草藥，對膀胱炎的治療，并觀察這些藥物的潛在不良反應意義深遠。本研究通過向雌性SD大鼠膀胱內(nèi)植入異物+灌注大腸埃希菌液，制作感染性大鼠膀胱炎動物模型，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1材料及實驗分組：雌性成年SD大鼠63只,個體質(zhì)量(170±10)g，由上海中醫(yī)藥大學動物實驗學部提供[動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(滬)2009-0021],分籠飼養(yǎng),自由飲水；隨機分為三組，每組21只：實驗組(膀胱內(nèi)植入異物+大腸埃希菌1次灌注)、大腸埃希菌灌注組和生理鹽水灌注組。各組大鼠實驗開始時體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。膀胱灌注用DH5α大腸桿菌溶液(108-9CFU/100 μl) 由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院檢驗科提供。

1.2動物模型制作：實驗組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液(10%水合氯醛按0.3 ml/100 g)0.3～0.5 ml，麻醉后將大鼠固定，尿道口用70%乙醇和碘酊消毒，將直徑1.4 mm的圓頭軟質(zhì)金屬導絲沾上無菌甘油后經(jīng)尿道插入大鼠膀胱內(nèi)，導絲另一端套上長6～8 mm、直徑3 mm聚乙烯材料的導管，再套上推管，順著導絲用推管把導管推入膀胱并留置，拔出導絲，排空膀胱內(nèi)尿液，針筒吸入0.5 ml大腸桿菌溶液由推管注入膀胱后，拔出推管結(jié)束(見圖1)。大腸埃希菌灌注組和生理鹽水灌注組在同樣的麻醉方法后，將無菌的連續(xù)硬膜外導管(PE50管)經(jīng)尿道插入大鼠膀胱內(nèi)；排空尿液后分別注入0.5 ml大腸桿菌溶液和0.5 ml生理鹽水，間隔24 h后采用同樣方法重復操作一次，共3次，相同條件,自由飼養(yǎng)。

1.3觀察指標：12 d后處死大鼠，切開腹腔，取出膀胱并剪開，實驗組觀察異物導管是否殘留(見圖2)，無菌棉拭子涂搽膀胱內(nèi)壁作細菌培養(yǎng)，剪下部分膀胱組織，行蘇木精-伊紅染色(HE染色)，做成病理切片，分別置于100 倍、200倍顯微鏡下觀察膀胱黏膜固有層炎性細胞浸潤情況，膀胱肌層是否有異常病理表現(xiàn)。

圖1 實驗組的造模步驟

圖2 觀察實驗組膀胱內(nèi)導管的情況

2 結(jié)果

2.1造模結(jié)束時大鼠體重與死亡率比較：實驗結(jié)束時,各組大鼠無死亡發(fā)生，各組大鼠體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。實驗組有1例膀胱內(nèi)導管自行排出。

2.2各組間常規(guī)病理切片比較：通過病理切片觀察，實驗組中18例出現(xiàn)感染性膀胱炎表現(xiàn)，可見黏膜明顯水腫、增厚，黏膜及基質(zhì)內(nèi)可見大量單核炎癥細胞浸潤，有聚集成堆的現(xiàn)象，并可見毛細血管充血和出血(見圖3)；大腸埃希菌灌注組6例膀胱黏膜固有層有炎性細胞浸潤，病變程度比實驗組輕；生理鹽水組除3例固有層有炎性細胞輕度浸潤，其他膀胱黏膜上皮基本正常。實驗組膀胱炎發(fā)生18例，與大腸埃希菌灌注組(6例)及生理鹽水灌注組(3例)比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

2.3各組間大腸埃希菌培養(yǎng)結(jié)果的比較：實驗組膀胱內(nèi)大腸埃希菌培養(yǎng)陽性16例，與大腸埃希菌灌注組(8例)及生理鹽水灌注組(1例)比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

圖3 病理切片觀察典型的感染性膀胱炎發(fā)病情況

表1 各組間大鼠膀胱炎發(fā)生情況及細菌培養(yǎng)結(jié)果比較[例(%)]

組別例數(shù)膀胱炎膀胱內(nèi)涂片大腸埃希菌培養(yǎng)陽性實驗組2118(85.7)16(76.2)大腸埃希菌灌注組216(28.6)①8(38.1)①生理鹽水灌注組213(14.3)①1(4.8)①

注：與實驗組比較，①P<0.001

3 討論

目前國內(nèi)外文獻報道制作大鼠膀胱炎動物模型分為無菌性和感染性兩種。常用的制作方法有腹腔注射、膀胱灌注及外科手術(shù)干預等，差別是藥物作用于整體與局部的區(qū)別，各種方法所建的膀胱炎模型各有優(yōu)缺點[1-2]。

腹腔注射方法通常用于制作無菌性膀胱炎動物模型。其操作簡單，以環(huán)磷酰胺溶液每3天向腹腔注射1 次，建模成功率高，3 次給藥后建模成功率為90%，但大鼠狀態(tài)較差，建模后5 d死亡率可達80%，這與環(huán)磷酰胺對大鼠的全身毒性有關。腹腔注射經(jīng)腹膜吸收，其代謝產(chǎn)物作用于膀胱及全身各器官，產(chǎn)生膀胱過度刺激，同時對其他器官也產(chǎn)生損害，可用于病理及膀胱動力病因?qū)W等方面的短期或離體研究[3-5]。

膀胱灌注法可以建立無菌性或感染膀胱炎模型，過程略復雜，常用的灌注劑有環(huán)磷酰胺、硫酸魚精蛋白、大腸埃希菌等。麻醉后自大鼠尿道向膀胱內(nèi)灌注藥物，麻醉期間藥物直接作用于膀胱組織，可使藥物在膀胱滯留以維持較高藥物濃度，對其他器官的影響少，但由于麻醉2～3 h后大鼠清醒自主排尿，排出大部分藥物，導致建模成功率較低(約50%)[6-8]。

通過外科手術(shù)方式制作感染性膀胱炎模型一般有兩種:①切開腹腔暴露膀胱，根據(jù)實驗需要進一步切開膀胱或膀胱頸部縫合等，這種方式造模成功率100%，但術(shù)后5～7 d繼發(fā)感染大鼠死亡率可達70%[9]；②經(jīng)尿道介入方式建立感染性膀胱炎模型，韓國 HeeYoun Kim等報道采取尿道置入橡皮片，用線縫合固定于陰道壁上，建立了尿道炎模型[10]。日本學者 Yuichi Kurosaka等將長2 cm螺旋狀聚乙烯管經(jīng)尿道植入大鼠膀胱中建立感染性膀胱炎模型[11]，但實驗中發(fā)現(xiàn)雌性大鼠尿道有2 cm長、直徑細且螺旋狀彎曲，植入操作非常困難且易損傷尿道，難以推廣。

本組實驗采取經(jīng)尿道介入方法，在Yuichi Kurosaka等基礎上進行改進，方法如下：通過大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液 0.3～0.5 ml麻醉，將直徑1.4 mm的圓頭軟質(zhì)金屬導絲沾上無菌甘油后經(jīng)尿道插入大鼠膀胱內(nèi)，導絲另一端套上長6～8 mm、直徑2 mm聚乙烯材料的導管，再套上推管(直徑3 mm)，順著導絲用推管把導管推入膀胱并留置，拔出導絲，排空膀胱內(nèi)尿液，針筒吸入0.5 ml大腸桿菌溶液由推管注入膀胱后拔出推管，完成造模過程(見圖1)。本實驗21例雌性大鼠通過尿道向膀胱內(nèi)植入導管，操作過程簡單，造模后無大鼠死亡發(fā)生，術(shù)后12 d處死大鼠，病理切片檢查發(fā)生膀胱炎18例，發(fā)生率達到85.7%，與大腸埃希菌灌注組成功6例及生理鹽水灌注組成功3例比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；1例未發(fā)生膀胱炎是因為導管排出，另2例原因不詳。分析發(fā)生感染性膀胱炎機理如下：經(jīng)尿道注入的大腸桿菌黏附導管表面，形成一個持續(xù)感染灶——菌斑，由于導管在膀胱內(nèi)活動刺激損傷膀胱黏膜，產(chǎn)生了感染性膀胱炎模型。

本實驗造模時植入導管過程簡便，只需大腸桿菌液一次注入就能達到較高的成功率，通過本實驗,為批量制作提供了一種簡單、可行性高的感染性膀胱炎動物模型的實驗方法。