張 亮，盛 浩，譚 麗，袁 紅，易建平，鄧立平

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院，湖南 長沙 410128；2.醴陵市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局土壤肥料工作站，湖南 醴陵 412200；3.醴陵市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖南 醴陵 412200；4.醴陵市農(nóng)技推廣中心，湖南 醴陵 412200）

化肥和農(nóng)藥在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用，然而隨著化肥與農(nóng)藥使用量的逐年增加，其殘留物對環(huán)境造成了巨大危害。在提倡高產(chǎn)、高效、綠色農(nóng)業(yè)的大背景下，高效、復合型促生菌的研究與應用為尋求傳統(tǒng)化肥、農(nóng)藥替代產(chǎn)品以及修復受損土壤環(huán)境指明了方向。根際促生菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR）泛指一類自由生長在根際土壤環(huán)境中或根系內(nèi)部，并具有促進植物生長或增加作物產(chǎn)量、抑制病蟲害能力的根際細菌，其對克服土壤逆境、改善微生態(tài)環(huán)境具有特殊意義[1]。目前為止，國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的具有防病促生潛能的根際微生物有20多個種屬，包括根瘤菌、沙雷氏屬、熒光假單孢菌、芽孢桿菌等[2]。上述根際促生菌對于植物的促生機制主要包括合成對于植物生長發(fā)育有直接促進作用的物質(zhì)[如吲哚乙酸（IAA）等植物激素]、改變元素形態(tài)促進植物對于養(yǎng)分的吸收等（如固氮、解磷）[2-8]；然而，大多數(shù)菌株在克服養(yǎng)分、病害逆境時功能較為單一；因此，篩選獲得具有復合能力的促生菌株，對高效改善根際營養(yǎng)與調(diào)控土壤微生態(tài)環(huán)境具有非常重要的意義。

油菜（Brassica napusL.）和黃瓜（Cucumis sativusL.）均為我國大面積種植作物，特別是油菜，因其花期之前可作菜用，花期之后籽?？烧ビ投哂小坝汀思骖櫋敝厣谖覈卟撕褪秤糜皖I(lǐng)域占有重要地位[9]。本研究以稻—油不同輪作條件下的耕層土壤為樣本，擬通過選擇性培養(yǎng)方法獲得兼具固氮、解磷以及產(chǎn)IAA能力的復合型高效促生菌株，并通過盆栽試驗對其促生效果予以驗證。本研究不僅能夠為蔬菜種植養(yǎng)分培育資源的更廣闊替代利用提供優(yōu)良促生菌株材料，還可以從可培養(yǎng)耕層土壤促生菌數(shù)量的角度揭示稻—油輪作制度對地力生態(tài)功能維護的優(yōu)勢。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試土壤與種子

土壤為稻—油輪作與稻—稻輪作耕層土壤，位于湖南瀏陽的農(nóng)大稻—油輪作試驗田。

油菜品種為常雜油菜3號，購于湖南省農(nóng)業(yè)科學院湘科種苗集團。黃瓜品種為蔬研十號，購于湖南興蔬種業(yè)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

肉湯酵母培養(yǎng)基（NBY）：營養(yǎng)肉湯粉8 g，酵母提取物2 g，磷酸氫二鉀2 g，磷酸二氫鉀0.5 g，葡萄糖2.5 g，1 mol/L七水合硫酸鎂1 mL，去離子水1 L，瓊脂15 g，pH值7.5。

固氮培養(yǎng)基（阿須貝培養(yǎng)基+無N培養(yǎng)基）：蘋果酸2 g，三水合磷酸氫二鉀0.5 g，七水合硫酸鎂0.2 g，氯化鈉0.1 g，二水合氯化鈣20 mg，鉬酸鈉2 mg，氫氧化鉀4.5 g，5%溴百里酚5 mL，維生素H 10 mg，瓊脂15 g，去離子水1 L，pH值7.5。

解磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，磷酸鈣5 g，六水合氯化鎂5 g，七水合硫酸鎂0.25 g，氯化鉀0.2 g，硫酸銨0.1 g，瓊脂15 g，去離子水1 L，pH值7.0。

液體LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，去離子水950 mL，pH值7.0。

IAA檢測培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基：胰蛋白胨17 g，植物蛋白胨3 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鉀2.5 g，葡萄糖2.5 g，色氨酸100 μg/mL，最終pH值7.3±0.2。

1.2 試驗方法

1.2.1 復合促生菌株篩選試驗

土壤可培養(yǎng)細菌分離采用連續(xù)稀釋法，具體步驟為：稱取10 g土壤于置有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中，振蕩搖勻30 min（180 r/min），靜置5 min，分別吸取1 mL懸液加入置有9 mL無菌水的滅菌試管中，后依次連續(xù)稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等不同濃度，吸取不同濃度混合液100 μL并涂布于NBY培養(yǎng)皿中，于25 ℃條件倒置培養(yǎng)于生化培養(yǎng)箱中。

菌株純化：每隔12 h觀察上述培養(yǎng)皿生長情況，待菌落生長至適合形態(tài)時，用接種棒挑取單菌落劃線至NBY培養(yǎng)皿，25 ℃條件倒置培養(yǎng)于生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，備用。

促生菌初篩：分別將純化后的菌株接種于固氮、解磷培養(yǎng)基，室溫條件培養(yǎng)，每隔12 h觀察菌株生長情況，在2種固氮培養(yǎng)皿上同時可以良好生長的菌株記為固氮菌，在解磷培養(yǎng)基上可觀察到清澈透明圈的菌株記為解磷菌，所有記號菌株均另劃線接種至新NBY培養(yǎng)皿、編號、室溫培養(yǎng)3 d，后轉(zhuǎn)至4 ℃低溫保存，備用。

促生菌復篩：將疑似菌株重復進行固氮解磷培養(yǎng)試驗，以檢驗效果是否準確，同時將疑似固氮解磷菌株分別接種至含有5 mL液體LB培養(yǎng)基的10 mL試管中，于170 r/min，28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)48 h，后加入Salkowsky生長素顯色試劑，觀察顯色反應，確定其產(chǎn)IAA能力強弱，如顯粉紅色則為產(chǎn)生長素菌株，記號并進行生長素定量檢測。

IAA定量檢測[10]：接種于IAA檢測培養(yǎng)基的各生防菌株在24 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h后，經(jīng)12 000 r/min離心10 min，1 mL菌懸液加入2 mL Salkowsky試劑并混勻，于28 ℃培養(yǎng)30 min后得到粉色顯色，并在530 nm條件下進行比色，以10～100 μg/mL的標準IAA稀釋液設置標準曲線，單位表示為μg/mL。

1.2.2 盆栽促生試驗

采用人工氣候箱培育油菜和黃瓜幼苗，具體步驟為：（1）土壤（過2 mm篩風干土）裝杯；（2）供試促生菌經(jīng)純化后接種于100 mL NBY液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)48 h，備用；（3）將形態(tài)一致的油菜種子、黃瓜種子分別于各菌株發(fā)酵液中浸種10 min，后均勻播種于上述土杯中（每杯5粒），并將剩余菌液倒入各處理土壤，以清水作為對照；（4）培養(yǎng)于人工氣候箱中。培養(yǎng)條件：28 ℃光照16 h+16 ℃無光8 h。

試驗設無菌對照處理和已篩選出的不同復合菌株處理，各處理重復10杯，日常管理。10 d后觀察記錄不同處理油菜、黃瓜幼苗植株鮮質(zhì)量、根長、株高等生長指標。

2 結(jié)果與分析

2.1 固氮、解磷菌株初篩結(jié)果

從表1可以得出，篩選并純化處理后，最終獲得稻—稻輪作土壤中可分離菌株194株，稻—油輪作土壤中可分離菌株208株。

通過選擇性培養(yǎng)基專性生長培養(yǎng)法，初步篩選共獲得固氮菌73株，其中稻—稻輪作土壤獲得35株，稻—油輪作土壤獲得38株；解磷菌38株，其中稻—稻輪作土壤獲得3株，稻—油輪作土壤獲得35株（表1）。

表1 固氮、解磷菌株篩選結(jié)果 株

2.2 固氮、解磷菌株復篩驗證

通過對比2種不同種植制度中所獲解磷菌與固氮菌編號（圖1、圖2）發(fā)現(xiàn)，同時兼具解磷與固氮效果的復合菌株編號為：59、69、79號（稻—稻）；6、7、14、107、110、111、112號（稻—油）。

2.3 復合型固氮解磷菌產(chǎn)IAA能力定量檢測

通過對兼具固氮與解磷特性的復合菌株進行產(chǎn)IAA能力定量檢測后發(fā)現(xiàn)，DD-69、DD-79、DY-6、DY-7、DY-111、DY-112具有較強的IAA分泌能力（＞10 μg/mL），其濃度范圍為10.09～12.59 μg/mL（表2）。

2.4 盆栽促生實驗結(jié)果分析

如表3所示，與對照相比，篩選出的6株復合型促生菌對油菜和黃瓜幼苗早期株高的生長普遍具有顯著的促進效果，其增幅分別為25.45%～111.96%和4.45%～18.22%，以DD-69最佳；促生菌DY-6與DY-7菌株對油菜幼苗早期根系生長具有一定促進效果，DD-79、DY-111菌促生效果均不顯著；促生菌DD-69與DY-111對黃瓜幼苗早期根系生長具有一定促進效果，且與CK和其他菌株差異顯著；促生菌對油菜幼苗早期鮮質(zhì)量的影響差異不顯著，但促生菌DY-6和DD-79對黃瓜幼苗早期鮮質(zhì)量具有顯著促生效果。

表2 產(chǎn)IAA能力檢測結(jié)果（部分菌株）

3 結(jié)論與討論

本研究通過選擇性培養(yǎng)基分離等傳統(tǒng)微生物技術(shù)對稻—稻輪作與稻—油輪作制度下耕層水稻土壤中的促生細菌進行了分離與篩選工作，結(jié)果表明稻—稻輪作耕層土壤中分離獲得194個菌株，其中含固氮菌35株、解磷菌3株；稻—油輪作耕層土壤中分離獲得208個菌株，其中含固氮菌38株、解磷菌35株。復合驗證結(jié)果顯示，兼具固氮、解磷以及較強生長素分泌能力的促生菌株共6株，分別為DD-69、DD-79、DY-6、DY-7、DY-111、DY-112，其IAA分泌濃度為10.09～12.59 μg/mL。經(jīng)人工氣候箱培育試驗發(fā)現(xiàn)，獲得的6株復合型促生菌普遍對油菜和黃瓜早期幼苗株高生長具有一定的促生效果，尤其是有利于幼苗株高的生長。

根際促生菌（PGPR）是一類根際環(huán)境友好型微生物，具有改善土壤理化性質(zhì)、提高土壤肥力、抑制病蟲害發(fā)生等重要農(nóng)業(yè)利用屬性[11]。對復合型高效促生菌的篩選是獲得這類有益微生物的必然途徑。本研究以稻—稻、稻—油等不同輪作制度的耕層水稻土壤為篩選材料，通過傳統(tǒng)微生物分離技術(shù)，對其中的固氮菌、解磷菌以及生長素代謝菌等可培養(yǎng)功能細菌進行了分離與篩選，并經(jīng)復篩與盆栽試驗對獲得的6株復合型促生菌株的促生效果予以了明確。這與前人[11]有關(guān)固氮、解磷菌促進作物生長的試驗結(jié)果一致。本研究中6株促生菌雖對油菜幼苗和黃瓜幼苗的早期生長具有一定促進效果，但對根系的促生效果普遍不夠顯著（DD-69和DY-111除外），這可能與接種劑量以及容重等土壤理化性狀有關(guān)[12]。此外，本研究結(jié)果還顯示出稻—油輪作制度下耕層水稻土壤中的可分離細菌以及具有固氮、解磷、產(chǎn)IAA能力促生菌可篩選數(shù)量明顯高于稻—稻輪作制度的種植土壤，從根際有益微生物的角度佐證了稻—油輪作制度對作物根際土壤生態(tài)環(huán)境的積極作用。

表3 促生菌對油菜、黃瓜幼苗生長的促進效果