李亞軍 黃河 牛雅靜 李霞

摘要：[目的]篩選菊花花粉離體培養(yǎng)生活力測(cè)定的最佳培養(yǎng)基配方，探究花粉貯藏的最適溫度和耐貯藏時(shí)間，并挑選出較耐貯藏的菊花品種，為菊花新品種選育和種質(zhì)資源保存提供參考。[方法]以10個(gè)菊花品種盛花期花粉為試驗(yàn)材料，通過離體萌發(fā)測(cè)定法篩選菊花花粉萌發(fā)最適培養(yǎng)基，以該培養(yǎng)基測(cè)定花粉在4℃、-20℃和-80℃3種溫度下進(jìn)行60d或120d貯藏周期的生活力變化趨勢(shì)觀測(cè)，每隔15d取樣檢測(cè)1次;對(duì)貯藏120d的花粉進(jìn)行授粉，統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)率。[結(jié)果]培養(yǎng)基為ME₃+200g·L^-1PEG4000+6g·L^-1瓊脂的處理，10種花粉都能萌發(fā)，且萌發(fā)率較其他培養(yǎng)基有顯著差異;花粉貯藏60d后，所有花粉生活力均下降，其中‘5‘52‘64和‘854個(gè)品種花粉生活力下降較緩慢;4種花粉貯藏120d后，在-80℃貯藏的花粉生活力較高，花粉授粉后均能夠結(jié)實(shí)，且品種‘5花粉授粉結(jié)實(shí)率最高，平均每個(gè)授粉花序結(jié)實(shí)8粒。[結(jié)論]花粉萌發(fā)培養(yǎng)基、植物品種基因型、貯藏溫度和貯藏時(shí)間都會(huì)影響菊花花粉生活力。本文研究表明，菊花花粉最適貯藏溫度為-80℃，品種‘5花粉可貯藏120d保持較高的授粉結(jié)實(shí)率，在雜交育種中可優(yōu)先考慮。

關(guān)鍵詞：菊花，花粉生活力，貯藏，授粉

中圖分類號(hào)：S682.1+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-0384（2020）03-0295-08

0 引言

（研究意義）花粉是植物遺傳信息的載體和交流工具，花粉貯藏是保存種質(zhì)資源最簡潔、高效的途徑。在雜交育種工作中，花粉貯藏能夠解決親本花期不遇和遠(yuǎn)距離雜交問題，打破雜交親本的空間和時(shí)間隔離。菊花（Chrysanthemum X morifolium Ramat.）是菊科菊屬植物，在世界各地園藝造景中廣泛應(yīng)用，雜交育種是培育菊花新品種的主要手段。因而探討菊花花粉最佳貯藏條件對(duì)于解決菊花近緣屬間雜交以及品種間雜交所面臨的花期不遇或遠(yuǎn)距離雜交等問題具有重要意義，同時(shí)在使用貯存花粉之前，選擇合適的方法對(duì)花粉生活力進(jìn)行測(cè)定，可確保選擇了最優(yōu)花粉進(jìn)行人工授粉而得到性狀優(yōu)良的后代。（前人研究進(jìn)展）不同物種最適花粉貯藏條件差異較大，且同一物種花粉貯藏時(shí)間不同，最適溫度不同。如在月季、杜鵑花、接骨木等觀賞植物中發(fā)現(xiàn)，低溫干燥貯藏有利于延長花粉壽命;對(duì)海棠花粉和梅花花粉的研究發(fā)現(xiàn)，4℃是其花粉貯藏的最適溫度;而對(duì)大白花杜鵑花粉貯藏生活力的研究發(fā)現(xiàn)，花粉貯藏30d以內(nèi)時(shí)，-80℃條件下貯藏花粉生活力最高，而貯藏30d以上時(shí)，-16℃條件下貯藏花粉生活力最高。此外，快速準(zhǔn)確測(cè)定不同品種花粉生活力，可為正確選擇雜交組合提供重要的參考依據(jù)，也是保證雜交育種工作順利進(jìn)行的關(guān)鍵?；ǚ凵盍y(cè)定方法有染色法、活體萌發(fā)法、離體萌發(fā)法以及田間雜交授粉等方法，其中田間雜交授粉法和離體萌發(fā)法分別是定性測(cè)定和定量測(cè)定花粉生活力的有效方法，而離體萌發(fā)培養(yǎng)基的組分對(duì)花粉萌發(fā)也具有重要影響。（本研究切人點(diǎn)）關(guān)于菊花花粉貯藏方法已有研究，但研究的貯藏周期較短，并缺少相應(yīng)的授粉結(jié)實(shí)率的驗(yàn)證。（擬解決的關(guān)鍵問題）本研究以課題組自育的10個(gè)不同基因型菊花品種花粉為試驗(yàn)材料，設(shè)置不同花粉萌發(fā)培養(yǎng)基和貯藏溫度，進(jìn)行120d貯藏周期內(nèi)花粉生活力的測(cè)定，并通過田間雜交授粉進(jìn)一步驗(yàn)證貯藏溫度對(duì)花粉生活力的影響。探究菊花花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基，適合菊花花粉貯藏的溫度及適宜的貯藏時(shí)間，并尋找出10個(gè)菊花品種中較耐貯藏的品種，為菊花種質(zhì)資源的保存及雜交育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗(yàn)材料為課題組通過荷蘭引進(jìn)的Time小菊系列與中國傳統(tǒng)菊花雜交所獲得的10個(gè)優(yōu)良菊花品種：‘5、‘16、‘22、‘30、‘45、‘52、‘64、‘85、‘132、‘317（圖1）。該10個(gè)菊花品種觀賞性狀較好，但自然花期偏晚（表1），因此會(huì)與花期早的菊花品種出現(xiàn)花期不遇現(xiàn)象。2018年11月于各品種于盛花期晴天上午10：00～12：00時(shí)，在北京植物園宿根花卉園菊花圃內(nèi)用毛筆將花粉掃至2mL離心管中并帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行貯藏和花粉生活力測(cè)定。

1.2花粉生活力測(cè)定

1.2.1 最佳花粉萌發(fā)培養(yǎng)基篩選 蔗糖和硼酸對(duì)花粉的萌發(fā)和花粉管的伸長有重要作用，聚乙二醇（PEG）能夠促進(jìn)菊花花粉對(duì)蔗糖和硼的吸收。本試驗(yàn)共設(shè)7種花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基：①50g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸;②100g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸;③150g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸;④200g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸;⑤ME3+6g·L^-1瓊脂;⑥ME₃+200g·L^-1蔗糖+6g·L^-1瓊脂;⑦M(jìn)E₃+200g·L^-1PEG4000+6g·L^-1瓊脂。其中ME3培養(yǎng)基配方參考Widrle-chner等的配方，7種培養(yǎng)基pH為5.8～6.0.

1.2.2離體萌發(fā)測(cè)定花粉萌發(fā)率 花粉萌發(fā)率是衡量花粉生活力的主要標(biāo)志。取配制好的7種液體培養(yǎng)基50uL滴于載玻片上，取50uL蒸餾水滴人凹玻片凹槽內(nèi)，然后將花粉均勻撒播在液體培養(yǎng)基表面，載玻片向內(nèi)翻轉(zhuǎn)蓋到凹玻片上，保證花粉處在均衡的環(huán)境中。將凹玻片放人鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，放人25℃恒溫箱中培養(yǎng)2h，在40倍顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況，萌發(fā)的花粉管長度超過花粉直徑則為萌發(fā)。每個(gè)處理重復(fù)3次，每重復(fù)隨機(jī)選取3個(gè)視野觀察，每個(gè)視野的花粉總數(shù)大于50粒，統(tǒng)計(jì)花粉?？倲?shù)和已萌發(fā)花粉粒總數(shù)?；ǚ勖劝l(fā)率=（已萌發(fā)的花粉粒數(shù)量/花粉粒總數(shù)量）×100%，取3個(gè)視野平均值作為花粉萌發(fā)率。

1.3貯藏條件設(shè)置

1.3.1花粉耐貯藏品種篩選 采集10個(gè)菊花品種盛花期花粉，并用2mL試管分裝成小份進(jìn)行貯藏。測(cè)定10個(gè)品種花粉原始生活力和60d貯藏周期后花粉生活力，比較不同品種花粉生活力變化情況，篩選出生活力較高的菊花品種。之后繼續(xù)貯藏60d，比較貯藏周期120d后田間授粉結(jié)實(shí)率，篩選出花粉最耐貯藏品種。

1.3.2 貯藏溫度和貯藏時(shí)間對(duì)花粉生活力的影響將60d貯藏周期后篩選出的花粉繼續(xù)貯藏在4℃、20℃、-80℃條件下，每隔15d測(cè)定1次花粉生活力，繼續(xù)測(cè)定60d，觀察花粉在120d貯藏周期內(nèi)不同溫度下不同貯藏時(shí)間段的生活力變化趨勢(shì)，得到花粉生活力維持在較高狀態(tài)且下降緩慢的臨界貯藏時(shí)間，以及在長期貯藏情況下的最佳貯藏溫度。同時(shí)在貯藏120d后，比較不同貯藏溫度下花粉的授粉結(jié)實(shí)率，進(jìn)一步驗(yàn)證菊花花粉貯藏的最適溫度。

1.4 田間雜交授粉

選取生長健壯，自然花期較早且具有較高觀賞性的菊花品種‘45作母本，通過花期調(diào)控使其在2019年3月開花;取在3種溫度下貯藏120d的貯藏花粉，以及經(jīng)過花期調(diào)控于2019年3月開花的相對(duì)應(yīng)品種的新鮮花粉分別作父本。根據(jù)Huang等對(duì)菊花舌狀花發(fā)育級(jí)別的劃分，選取舌狀花微微展開的S3級(jí)別花序進(jìn)行剪辦、去雄和套袋。剪辦5～6d后，雌蕊成熟伸出花冠筒呈“Y”字形并伴有光澤，用毛筆蘸取采集的新鮮花粉和貯藏花粉分別涂抹于柱頭上進(jìn)行授粉。每個(gè)雜交組合選擇10個(gè)花序授粉，每個(gè)花序授粉3～5次。2個(gè)月后采集干枯花序凈種，通過比較結(jié)實(shí)率進(jìn)一步探索適合菊花花粉貯藏的溫度和耐貯藏的品種。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Excel軟件和SPSS軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1 最佳菊花花粉萌發(fā)培養(yǎng)基的篩選

試驗(yàn)選取了7種含有不同成分、可能適合菊花花粉離體萌發(fā)的培養(yǎng)基，通過測(cè)定10個(gè)菊花品種花粉在7種培養(yǎng)基上的萌發(fā)率，確定最適合菊花花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基。

由表2可知，以50g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸、100g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸和ME₃+6g·L^-1瓊脂作為培養(yǎng)基進(jìn)行花粉離體萌發(fā)測(cè)定時(shí)，10個(gè)菊花品種花粉萌發(fā)率全都為0;而150g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸、200g·L^-1蔗糖/0.6g·L^-1硼酸、ME₃+200g·L^-1蔗糖+6g·L^-1瓊脂以及ME₃+200g·L^-1PEG 4000+6g·L^-1脂作為花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基時(shí)，10個(gè)菊花品種花粉都有一定萌發(fā)率。說明低濃度蔗糖不適合菊花花粉萌發(fā)，較高濃度的蔗糖（>150g·L^-1）能夠促進(jìn)花粉萌發(fā)，且單獨(dú)的ME3培養(yǎng)基不能促進(jìn)花粉萌發(fā)。進(jìn)行方差分析和多重比較，結(jié)果表明以7號(hào)培養(yǎng)基為花粉萌發(fā)培養(yǎng)基時(shí)，品種‘5、‘45、‘132的花粉萌發(fā)率最高，且與其他培養(yǎng)基上的花粉萌發(fā)率有顯著差異;7號(hào)、6號(hào)和4號(hào)培養(yǎng)基中，品種‘162‘22‘30‘5‘64和‘317的花粉萌發(fā)率無顯著差異，但在7號(hào)培養(yǎng)基中花粉萌發(fā)率最高。說明在ME₃基礎(chǔ)上添加適當(dāng)濃度PEG能夠提高菊花花粉萌發(fā)率。因此選擇7號(hào)培養(yǎng)基，即ME₃+200g·L^-1PEG 4000+6g·L^-1瓊脂培養(yǎng)基作為離體萌發(fā)法測(cè)定菊花花粉生活力的最佳培養(yǎng)基。

2.2 不同菊花品種花粉生活力的比較

花粉原始生活力對(duì)花粉貯藏壽命有較大影響，而原始生活力除了受花粉采集時(shí)間、植株開花狀態(tài)，當(dāng)天氣候狀況等外界因素影響外，也因品種的不同而表現(xiàn)出較大差異。由表3可知，在試驗(yàn)的10個(gè)菊花品種花粉中，品種‘5的花粉原始生活力以及貯藏60d后生活力與其他花粉相比均有顯著差異，且生活力最高，4℃、-20℃、-80℃貯藏60d后花粉萌發(fā)率分別為3.51%、3.61%、3.86%;另外9個(gè)品種的花粉在貯藏60d后生活力排名由高到低依次為‘85、‘16、‘22、‘52、‘132、‘64、‘45、‘30‘317。由圖2可知，10個(gè)菊花品種花粉在3種溫度下貯藏60d后生活力下降值從小到大依次為‘45、‘85、‘132、‘22、‘64、‘30、‘5、‘52、‘16‘317。綜合考慮10個(gè)小菊品種相關(guān)性狀，花粉原始生活力及貯藏60d后花粉生活力下降值，最終選擇‘5、‘52、‘64和‘85這4個(gè)品種的花粉進(jìn)行120d貯藏周期內(nèi)的最佳貯藏溫度篩選。

2.3 不同貯藏溫度及天數(shù)對(duì)菊花花粉生活力的影響

分別將在4℃、-20℃、-80℃ 3種溫度下貯藏120d的品種‘5、‘52‘64和‘85花粉在ME₃+200g·L^-1PEG 4000+6g·L^-1瓊脂的培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)率測(cè)定。由表3、4可以看出，隨著貯藏時(shí)間的延長，無論貯藏在哪種溫度下，4種花粉生活力都會(huì)逐漸降低。其中貯藏在-20℃的花粉生活力與貯藏在4℃花粉生活力相比，大部分有顯著差異，‘52花粉在貯藏60、75d時(shí)，-20℃貯藏與4℃貯藏的花粉生活力差異不顯著;貯藏在80"C的4種花粉生活力與貯藏在-2℃和4℃的花粉生活力相比，在每一個(gè)貯藏時(shí)間內(nèi)均有顯著差異，說明-80℃更適合4種花粉的貯藏。在-80℃貯藏溫度下，‘5花粉和‘85花粉在貯藏1-30d時(shí)花粉生活力無顯著差異，‘52花粉和‘64花粉在貯藏1-60d內(nèi)均有顯著差異，在貯藏60-75d時(shí)差異不顯著。綜上，在進(jìn)行菊花花粉貯藏時(shí)，選擇-80℃貯藏，且貯藏周期在30d內(nèi)，能夠保持花粉具有較高的生活力。

2.4 雜交授粉比較不同品種和貯藏溫度對(duì)花粉生活力的影響

雜交授粉法基本原理是根據(jù)果實(shí)和種子的形成情況判斷花粉生活力，該方法能夠更加真實(shí)客觀地反映花粉生活力。為了進(jìn)一步探索貯藏溫度對(duì)菊花花粉生活力的影響，并篩選出耐貯藏菊花品種，將在3種溫度下貯藏了120d的4個(gè)品種貯藏花粉和新鮮花粉分別進(jìn)行雜交授粉試驗(yàn)，經(jīng)過2個(gè)月得到雜交種子。表5為新鮮花粉做父本的授粉結(jié)果，表6為貯藏花粉做父本的授粉結(jié)果。

通過對(duì)比表中數(shù)據(jù)可知，貯藏花粉授粉后所得種子數(shù)明顯低于新鮮花粉授粉所得種子數(shù)，說明花粉經(jīng)過一段時(shí)間貯藏后，花粉生活力會(huì)下降。品種‘5花粉經(jīng)-80℃貯藏120d后，依然能夠結(jié)實(shí)，結(jié)實(shí)率顯著高于‘52花粉、‘64花粉和‘85花粉。4種花粉在4℃條件下貯藏120d后都不能結(jié)實(shí);在-20℃條件下貯藏后，只有品種‘5花粉授粉能夠結(jié)實(shí)，其他3種花粉均無活性;在-80℃條件下貯藏后，4種花粉授粉都能夠結(jié)實(shí)。綜上可以看出，在經(jīng)過120d貯藏后，品種‘5花粉依然有較高授粉結(jié)實(shí)率，是最耐貯藏品種;在4℃貯藏環(huán)境菊花花粉全部喪失生活力，在-20℃貯藏環(huán)境僅部分耐貯藏品種花粉可保持生活力，在-80℃貯藏環(huán)境大部分品種花粉均具有生活力，雜交授粉后能夠正常結(jié)實(shí)，說明-80℃更適合菊花花粉的長期貯藏。

3 討論與結(jié)論

3.1 離體萌發(fā)培養(yǎng)基對(duì)花粉生活力的影響

花粉是植物的雄配子體，是植物遺傳信息的載體和交流工具，花粉生活力的測(cè)定和貯藏條件的研究對(duì)于種質(zhì)資源的保存和育種工作的開展具有重要意義。離體萌發(fā)法是測(cè)定大多數(shù)植物花粉生活力的常用方法，蔗糖、硼酸和鈣等微量元素是花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基的主要成分，但對(duì)不同植物所需要的濃度可能是不同的。玫瑰、牡丹等植物花粉萌發(fā)最適蔗糖質(zhì)量濃度為100～150g·L^-1，文冠果花粉萌發(fā)培養(yǎng)基最適蔗糖質(zhì)量濃度為150g·L^-1，花粉萌發(fā)率達(dá)到91.08%。在本研究中發(fā)現(xiàn)，在只添加蔗糖和硼酸的培養(yǎng)基中，200g·L^-1蔗糖質(zhì)量濃度更有利于菊花花粉萌發(fā)。但蔗糖培養(yǎng)液對(duì)同屬于菊屬的南京野菊、毛華菊和幾種栽培小菊花粉萌發(fā)均沒有顯著效果，說明蔗糖對(duì)不同種或不同品種植物作用不同，因而在測(cè)定植物花粉生活力時(shí)，需要先篩選出適合該種花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基，以使測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確。

PEG能夠使花粉內(nèi)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使膜的通透性提高，從而促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管生長。在本研究中，10個(gè)菊花品種花粉在ME₃+200g·L^-1PEG4000+6g·L^-1瓊脂培養(yǎng)基上均有相對(duì)較高的萌發(fā)率，且高于200g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸、ME₃+200g·L^-1蔗糖+6g·L^-1瓊脂，而花粉在單獨(dú)的ME₃培養(yǎng)基上萌發(fā)率為0，說明PEG能夠促進(jìn)菊花花粉萌發(fā)。有研究發(fā)現(xiàn)在PEG基礎(chǔ)上添加一定量的蔗糖能顯著促進(jìn)花粉萌發(fā)，但在二者的共同作用下，菊花花粉的萌發(fā)率是否大于單獨(dú)PEG或蔗糖對(duì)花粉萌發(fā)的作用，以及二者的最佳濃度配比是多少，都值得進(jìn)一步研究。

3.2 貯藏環(huán)境對(duì)花粉生活力的影響

影響花粉生活力的因素除了花粉自身遺傳特性外，還有溫度、濕度、光照、輻射等環(huán)境因素，溫度和濕度是影響花粉貯藏壽命的主要因素。一般來說，植物花粉在低溫下貯藏壽命更長，能保持較高的花粉生活力，且溫度越低，花粉生活力下降越緩慢。例如聚石斛花粉在-20℃冷凍濕潤、-20℃冷凍干燥、4℃冷藏濕潤、4℃冷藏干燥4種條件下貯藏90d后，花粉生活力依次為21.7%、6.4%、1.4%和0.0%，無論是干燥還是濕潤條件下，-20℃條件下貯藏花粉生活力都要明顯高于4℃。在斑葉堇菜的研究中發(fā)現(xiàn)，花粉最佳貯藏條件為-80℃，在貯藏360d后，花粉萌發(fā)率仍達(dá)到40.50%。王濤等也曾對(duì)菊花花粉的貯藏條件進(jìn)行研究，將菊花花粉分別以干燥和濕潤2種狀態(tài)貯藏在4℃、-20℃和-80℃條件下，發(fā)現(xiàn)水分和溫度是影響菊花花粉貯藏壽命的2個(gè)重要因素，菊花花粉適合濕潤貯藏，且-80℃更有利于菊花花粉的貯藏，但該研究僅探討了60d貯藏周期內(nèi)菊花花粉的貯藏溫度，未進(jìn)行更長周期的貯藏研究。本研究將10個(gè)菊花品種花粉分別貯藏在4℃、-20℃和-80℃條件下，并分別進(jìn)行了60和120d貯藏周期研究，發(fā)現(xiàn)無論是短期貯藏還是長期貯藏，-80℃貯藏條件下，花粉生活力均高于其他貯藏條件下花粉生活力。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)30d是菊花花粉貯藏時(shí)間節(jié)點(diǎn)，30d后花粉生活力均下降明顯，因此若進(jìn)行短期貯藏，在30d內(nèi)使用花粉可獲得較好的效果。但如果貯藏溫度繼續(xù)降低，花粉生活力是否會(huì)繼續(xù)升高，花粉貯藏時(shí)間節(jié)點(diǎn)是否能夠延長還有待進(jìn)一步討論。

此外，并不是在所有植物中，低溫都更有利于花粉的貯藏，如對(duì)海棠花花粉的研究，發(fā)現(xiàn)最適貯藏條件是4℃;周婷等發(fā)現(xiàn)朱頂紅‘蘋果花品種花粉最適貯藏條件是4℃+干燥劑，90d后依然有較高的活性;劉穎等在對(duì)梅花花粉最適貯藏溫度的研究中，將梅花花粉分別貯藏在4℃、-20℃、-40℃、-80℃4種溫度條件下，發(fā)現(xiàn)最適貯藏溫度為4℃，溫度過低導(dǎo)致細(xì)胞脫水，反而不利于梅花花粉貯藏。說明對(duì)于不同種植物來說，花粉貯藏最適溫度不同，冷凍貯藏并不適合所有植物。

綜上所述，ME₃+200g·L^-1PEG 4000+6g·L^-1瓊脂是本研究中菊花花粉離體萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基，而在PEG基礎(chǔ)上添加一定量的蔗糖是否能夠進(jìn)一步提高花粉萌發(fā)率有待進(jìn)一步研究。4℃、-20℃、-80℃ 3種貯藏溫度相比，-80℃更適合菊花花粉貯藏，能夠使菊花花粉保持相對(duì)較高的生活力，可以考慮作為菊花遠(yuǎn)距離雜交以及解決親本花期不遇時(shí)進(jìn)行花粉貯藏的最適溫度。在貯藏過程中，菊花花粉生活力均隨著貯藏時(shí)間延長而下降，30d內(nèi)花粉生活力差異不顯著，因而最好在30d內(nèi)完成授粉以提高結(jié)實(shí)率。品種‘5花粉在-80℃貯藏120d后授粉依然能夠結(jié)實(shí)，在雜交育種親本選擇時(shí)可優(yōu)先考慮。