王晶淼 趙柏萍

摘 要 黑曲霉具有完善和強大的蛋白翻譯以及修飾功能，可安全高效的表達(dá)同源或外源基因，是一個重要的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。但是在表達(dá)外源蛋白時表達(dá)量較少，蛋白折疊機制飽和或蛋白質(zhì)折疊錯誤被認(rèn)為是外源蛋白質(zhì)分泌表達(dá)的一個重要瓶頸。異源蛋白的不正確折疊會引發(fā)非折疊蛋白響應(yīng)，從而使與蛋白折疊、分泌和降解有關(guān)基因上調(diào)。通過激活非折疊蛋白響應(yīng)相關(guān)基因可以增加某些蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)量，但是對其規(guī)律和機制還缺乏深入系統(tǒng)的認(rèn)識。本文章主要從黑曲霉的表達(dá)系統(tǒng)及限速步驟，非折疊蛋白響應(yīng)及其相關(guān)調(diào)控基因，黑曲霉表達(dá)內(nèi)源蛋白及外源蛋白的研究進(jìn)展等內(nèi)容進(jìn)行研究。

關(guān)鍵詞 非折疊蛋白響應(yīng);黑曲霉;分泌表達(dá)蛋白

引言

黑曲霉分泌表達(dá)外源基因與表達(dá)內(nèi)源基因相比較表達(dá)量較少，通過不同途徑可以提高外源蛋白的表達(dá)量和分泌量，可以使黑曲霉表達(dá)外源蛋白的量與表達(dá)同源蛋白達(dá)到相當(dāng)?shù)乃?。而在分泌途徑中，未折疊蛋白反應(yīng)的激活及其相關(guān)的基因?qū)ζ涞恼{(diào)控對外源蛋白的表達(dá)分泌有積極的作用。本論文通過對黑曲霉的表達(dá)系統(tǒng)及限速步驟的研究和對非絲狀真菌非折疊蛋白響應(yīng)的研究來闡述非折疊蛋白響應(yīng)相關(guān)基因?qū)谇狗置诒磉_(dá)蛋白的影響。

1黑曲霉的表達(dá)系統(tǒng)及限速步驟

黑曲霉是非常常見的一種真菌，形狀呈現(xiàn)絲狀，其在對非絲狀真菌的蛋白基因進(jìn)行表達(dá)方面體現(xiàn)出了非常好的性能，同時在蛋白分泌、表達(dá)以及修飾方面也取得了非常好的效果，重組體在遺傳方面具有的特性非常穩(wěn)定。除此之外，黑曲霉在蛋白表達(dá)方面能夠獲得非常高的產(chǎn)量，胞外分泌率相對比較高，并且其對蛋白質(zhì)進(jìn)行折疊和修復(fù)的系統(tǒng)和真核細(xì)胞非常相近，以上的種種特性使得黑曲霉變成一種非常有前景的能夠生產(chǎn)異源蛋白的能夠?qū)λ拗鬟M(jìn)行表達(dá)的系統(tǒng)。相比較而言， 使用細(xì)菌在對蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)方面存在比較多的缺陷，使用細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)時產(chǎn)生的蛋白質(zhì)往往是以沒有活性的、難溶的包涵體形式存在，除此之外，蛋白質(zhì)還在翻譯后沒有相應(yīng)的機制對其進(jìn)行修飾和加工。蛋白質(zhì)被分泌后會被翻譯以及加工，實現(xiàn)糖基化并形成二硫鍵[1]。

黑曲霉適于表達(dá)同源蛋白，但對外源蛋白，分泌效率及產(chǎn)率明顯降低，下降幅度高達(dá)2-3個數(shù)量級。因此，如果需要獲得比較多的目的蛋白，就應(yīng)當(dāng)采取一系列的方法對野生的菌株進(jìn)行有目的的改造。選取適當(dāng)?shù)耐緩絹硎沟闷湓诒磉_(dá)外源蛋白時也具有比較高的分泌量，使其產(chǎn)量和表達(dá)同源蛋白時基本一致。在對蛋白進(jìn)行分泌的各種途徑中，蛋白質(zhì)的折疊能力非常重要，不管是對于同源蛋白還是異源蛋白，都是其進(jìn)行分泌的能力的關(guān)鍵瓶頸。未折疊蛋白反應(yīng)被激活，促進(jìn)了蛋白質(zhì)分泌。因此，未折疊蛋白的反應(yīng)是優(yōu)化黑曲霉中蛋白質(zhì)分泌的主要目標(biāo)之一。

2絲狀真菌非折疊蛋白響應(yīng)研究進(jìn)展

絲狀真菌由于其具有非常可觀的蛋白酶表達(dá)量及其高效分解纖維素的能力而被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，然而，絲狀真菌的應(yīng)用還存在著非常多的瓶頸，蛋白質(zhì)從真核細(xì)胞中分泌出來之后會發(fā)生折疊，進(jìn)而形成三級結(jié)構(gòu)，整個過程是需要在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被稱為細(xì)胞內(nèi)長生分泌蛋白的關(guān)鍵細(xì)胞器，對于分泌蛋白的形成來說具有極其重要的作用，分泌蛋白和膜蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)進(jìn)行折疊并逐漸變得成熟，然后傳遞到膜內(nèi)系統(tǒng)的其他分室，它們或者可以顯示在細(xì)胞表面，或者在細(xì)胞外部進(jìn)行釋放。蛋白質(zhì)被分泌之后，會在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)被以某種方式進(jìn)行正確的翻譯，然后被修飾完成之后被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外部，在經(jīng)過正確的翻譯以及修飾之后，蛋白質(zhì)會逐漸實現(xiàn)糖基化以及磷酸化，除此之外也有二硫鍵逐漸形成。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)富含蛋白質(zhì)和伴侶進(jìn)而影響蛋白質(zhì)折疊，若折疊機制飽和或者錯誤，蛋白質(zhì)開始積累，進(jìn)而引起未折疊蛋白質(zhì)響應(yīng)等相關(guān)調(diào)節(jié)機制以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的壓力。

3改變非折疊蛋白響應(yīng)途徑對表達(dá)異源蛋白的影響

根據(jù)研究，絲狀真菌在表達(dá)異源蛋白時能夠顯著地誘導(dǎo)非折疊蛋白響應(yīng)。通過修飾非折疊蛋白反應(yīng)途徑或特定組分可增加絲狀真菌中蛋白質(zhì)產(chǎn)量。異源蛋白的表達(dá)常常導(dǎo)致錯誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積聚，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)。在第一批被鑒定為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激上調(diào)的基因為分子伴侶 Bip A、二硫鍵異構(gòu)酶Pdi A和凝集素伴侶蛋白ClxA。通過單獨過表達(dá)這些基因來增加異源蛋白質(zhì)產(chǎn)量的嘗試在少數(shù)情況下是成功的。表明待產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的特定特征，例如糖基化位點，疏水片或二硫鍵需要不同的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白質(zhì)被上調(diào)。在由 DTT處理誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激期間，以及在黑曲霉中過表達(dá)人組織纖溶酶原激活物（t-PA），已經(jīng)顯示25種基因同樣被上調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)表明，根據(jù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的質(zhì)量和數(shù)量，調(diào)整非折疊蛋白響應(yīng)計劃以觸發(fā)適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)并抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力。組成型活性hacA的表達(dá)似乎足以重新編程黑曲霉中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和分泌途徑的下游組分。與該假設(shè)一致，在酵母釀酒酵母中已經(jīng)獲得了對非折疊蛋白響應(yīng)組成型活化的異源蛋白質(zhì)產(chǎn)生的積極作用。此外，當(dāng)非折疊蛋白相應(yīng)相關(guān)基因如 hacA，sstC，pdiA，gptA，ostA，eroA或 cnxA過表達(dá)和編碼 ERAD組分的基因時，也觀察到黑曲霉中異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和分泌增加。

4結(jié)束語

目前黑曲霉作為宿主表達(dá)外源蛋白，尤其是非絲狀真菌蛋白時，分泌表達(dá)量往往較低，已發(fā)現(xiàn)在分泌途徑中，非折疊蛋白響應(yīng)及其相關(guān)調(diào)控基因?qū)ν庠吹鞍椎谋磉_(dá)有一定作用。改變非折疊蛋白響應(yīng)途徑回對異源蛋白的表達(dá)產(chǎn)生一定影響。通過共表達(dá)非折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)基因能為黑曲霉中外源蛋白的優(yōu)化表達(dá)提供有價值的參考。

參考文獻(xiàn)

[1] 周慶欣.絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[D].山東：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.