錢 婧,仲安琪,王露丹,趙穗潤(rùn),嚴(yán)文靜,章建浩

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

黃魚(yú)由于蛋白質(zhì)含量高、肉質(zhì)鮮嫩以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn),其需求量日益增加,現(xiàn)已成為我國(guó)主要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類[1]。但由于黃魚(yú)的肌肉組織疏松且蛋白含量高,易受到致腐致病微生物的污染而發(fā)生腐敗變質(zhì)[2-3]。目前,凍藏保鮮技術(shù)是防止魚(yú)肉腐敗變質(zhì)常用的方法[4-5],然而該技術(shù)只能抑制微生物的生長(zhǎng),一旦魚(yú)體在室溫下解凍后,魚(yú)體本身的微生物將繼續(xù)繁殖生長(zhǎng),破壞魚(yú)肉品質(zhì)。因此,在魚(yú)體凍藏保鮮前進(jìn)行簡(jiǎn)單高效的初步殺菌顯得尤為重要,可降低后續(xù)的冷藏條件,減弱凍藏對(duì)魚(yú)肉品質(zhì)的影響。

本研究利用等離子體射流發(fā)生裝置制備等離子體活性水,將魚(yú)肉中常見(jiàn)的腸道病原微生物腸炎沙門(mén)氏菌作為菌體模型[14],評(píng)估等離子體活性水的抗菌活性及抗菌時(shí)效,同時(shí)測(cè)定活性水中長(zhǎng)效殺菌物質(zhì)的含量。將制得的等離子體活性水用于生鮮黃魚(yú)的初步殺菌,以生鮮黃魚(yú)片(2.5 cm×5 cm,10 g)為研究對(duì)象。通過(guò)浸泡接種法(腸炎沙門(mén)氏菌),確保魚(yú)體表面初始微生物數(shù)量的一致性,進(jìn)而探討等離子體活性水對(duì)生鮮黃魚(yú)片的殺菌效果,從色澤、pH、脂質(zhì)氧化、亞硝酸鹽殘留、肌肉持水力及氣味多方面地揭示等離子體活性水對(duì)魚(yú)肉品質(zhì)的影響,為等離子體活性水對(duì)黃魚(yú)初步殺菌的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生鮮大黃魚(yú) 南京蘇果超市;腸炎沙門(mén)氏菌(SalmonellaenteritidisCICC24119) 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;LB肉湯、SS瓊脂(SalmonellaShigellaagar) 青島海博生物技術(shù)有限公司;Amplex? UltraRed試劑盒 賽默飛世爾科技公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純 南京壽德生物科技有限公司。

PG-1000ZD低溫等離子體噴槍 南京蘇曼等離子科技有限公司;Allegra-64R臺(tái)式冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼公司;SJ-CJ-1D超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;SMIC型電熱滅菌鍋 上海醫(yī)用儀器廠;恒溫培養(yǎng)搖床 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;UV-2006 UV-Vis分光光度計(jì) 日本島津公司;數(shù)顯式pH測(cè)試儀 梅特勒-托利多儀器有限公司;IKA T25組織分散機(jī) 德國(guó)艾卡儀器設(shè)備有限公司;SpectraMax M2e多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)分子儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 等離子體活性水的制備及性能測(cè)定

1.2.1.1 等離子體活性水的制備 圖1為制備等離子體活性水所用的等離子體射流發(fā)生裝置示意圖。該裝置以空氣為工作氣體,流速為22.5 L/min,工作電流為0.024 mA,電壓為19 kV,頻率為20 kHz。本實(shí)驗(yàn)將等離子體射流裝置的噴槍口位置固定于液面下方15 mm,待處理去離子水體積為1000 mL,處理一定時(shí)間(1、2、3 min)后,立即置于密閉容器中,在室溫(25 ℃)條件下儲(chǔ)藏,每隔4 h測(cè)定其理化性質(zhì)(亞硝酸根、硝酸根、過(guò)氧化氫、pH)的變化情況。不同等離子體處理時(shí)間制得的等離子體活性水分別記為:PAW-1、PAW-2和PAW-3。

圖1 等離子體射流發(fā)生裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of plasma jet generator set-up

1.2.1.2 菌體懸濁液的制備 將腸炎沙門(mén)氏菌置于100 mL的LB肉湯中,37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)15 h。取對(duì)數(shù)期的菌液離心(10000×g,6 min),去上清,用無(wú)菌生理鹽水清洗菌斑3次,再重懸于生理鹽水中。利用分光光度計(jì)測(cè)量600 nm波長(zhǎng)下菌體懸浮液的吸光度值(OD),調(diào)整菌體懸濁液的濃度至108CFU/mL(相應(yīng)的OD值為0.2)。

1.2.1.3 等離子體活性水抗菌時(shí)效的測(cè)定 將制備好的等離子體活性水(PAW-1,PAW-2,PAW-3)室溫下儲(chǔ)藏24 h,每隔4 h測(cè)定其對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌的抗菌效果。等離子體活性水與菌體懸濁液(108CFU/mL)按1∶1體積比進(jìn)行混合,反應(yīng)15 min后立即進(jìn)行菌落數(shù)的測(cè)定,將去離子水處理作為對(duì)照組。對(duì)混合液進(jìn)行10倍梯度稀釋,選擇3個(gè)適宜的稀釋度,分別吸取100 μL稀釋液于SS瓊脂平板上(每組3個(gè)),涂布均勻,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,以lg CFU/mL進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.2.1.4 等離子體活性水中長(zhǎng)效殺菌物質(zhì)的測(cè)定 亞硝酸根及硝酸根含量按照國(guó)標(biāo) GB 5009.33-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)Amplex? UltraRed試劑盒的說(shuō)明書(shū)測(cè)定等離子體活性水(PAW-1,PAW-2,PAW-3)中過(guò)氧化氫的含量。在每100 μL的PAW中加入100 μL 10 mmol/L的試劑盒儲(chǔ)備液(含有辣根過(guò)氧化物酶),在37 ℃條件下反應(yīng)15 min,利用酶標(biāo)儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)為540 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為590 nm)。

1.2.1.5 等離子體活性水pH的測(cè)定 pH計(jì)校正后,將電極分別浸沒(méi)在PAW-1,PAW-2及PAW-3溶液中,待讀數(shù)穩(wěn)定后記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2 等離子體活性水對(duì)生鮮黃魚(yú)品質(zhì)的影響

1.2.2.1 樣品的制備及接種處理 采用無(wú)菌剪刀及手術(shù)刀在超凈臺(tái)內(nèi)制備黃魚(yú)生魚(yú)片(2.5 cm×5 cm,10 g),將生魚(yú)片放在紫外燈下照射以除去魚(yú)原本的菌體(魚(yú)片每面用紫外燈照射各40 min)。紫外滅菌后將生魚(yú)片浸沒(méi)于腸炎沙門(mén)氏菌溶液(106CFU/mL)中30 s,取出,在超凈臺(tái)中室溫靜置4 h,使菌體附著于魚(yú)肉。

1.2.2.2 等離子體活性水處理 隨機(jī)抽取染菌生魚(yú)片(每組3片,每片10 g),浸沒(méi)于不同的等離子體活性水(PAW-1,PAW-2,PAW-3)中30 s,取出,放置于無(wú)菌密封袋中后立即測(cè)定生鮮黃魚(yú)片上腸炎沙門(mén)氏菌的數(shù)量。隨機(jī)抽取未染菌生魚(yú)片(每組3片,每片10 g),浸沒(méi)于不同的等離子體活性水(PAW-1,PAW-2,PAW-3)中30 s,取出,測(cè)定魚(yú)片在色澤、pH、TBARS、亞硝酸鹽、持水力、氣味以及味感上的變化情況。以去離子水浸泡處理為對(duì)照組,每個(gè)處理組重復(fù)3次。

1.2.2.3 腸炎沙門(mén)氏菌的測(cè)定 向裝有待測(cè)樣品的無(wú)菌袋中加入110 mL無(wú)菌生理鹽水,均質(zhì)器以6次/s拍打2 min,10倍梯度稀釋,選擇3個(gè)適宜的稀釋度,分別吸取100 μL稀釋液于SS瓊脂平板上(每組3個(gè)),涂布均勻,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,以log CFU/g進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.2.2.4 色澤的測(cè)定 利用以標(biāo)準(zhǔn)白板(L*=95.35,a*=0.01,b*=2.30)校正的色差儀對(duì)樣品的顏色特征進(jìn)行評(píng)價(jià)。將色差儀垂直于樣品表面進(jìn)行測(cè)量,每個(gè)樣品測(cè)量5個(gè)點(diǎn),取其平均值。顏色值表示為L(zhǎng)*(+亮度,-黑暗)、a*(+紅色,-綠色)和b*(+黃色,-藍(lán)色)[15]。

1.2.2.5 pH的測(cè)定 按照國(guó)標(biāo)GB 5009.237-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2.6 TBARS的測(cè)定 按照國(guó)標(biāo)GB 5009.181-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中丙二醛的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2.7 亞硝酸鹽含量的測(cè)定 按照國(guó)標(biāo) GB 5009.33-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2.8 肌肉持水力的測(cè)定 將處理后的生鮮黃魚(yú)片剪碎(15±1 g,質(zhì)量記為m1/g),分別置于50 mL離心管中,在20000 r/min、4 ℃條件下離心15 min后,記錄魚(yú)肉質(zhì)量(m2/g)[16]。持水力計(jì)算公式如下:

式中:WHC表示魚(yú)體肌肉的持水力,%;m1表示離心前黃魚(yú)的總質(zhì)量,g;m2表示離心后黃魚(yú)的總質(zhì)量,g。

1.2.2.9 電子鼻的測(cè)定 將處理后的生鮮黃魚(yú)片剪碎(10±1) g,分別放入20 mL頂空瓶中。頂空瓶在37 ℃下水浴30 min,以達(dá)到穩(wěn)定的頂空成分。在每次測(cè)量之前,傳感器室都要用空氣進(jìn)行凈化,以便重新建立儀器的基線。頂空氣體以400 mL/min的速度泵入腔內(nèi)。傳感器的采集時(shí)間為120 s,可以使傳感器響應(yīng)信號(hào)達(dá)到穩(wěn)定值。應(yīng)用主成分分析法(PCA)對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析,以區(qū)分不同的處理方法[17]。

1.2.2.10 電子舌的測(cè)定 將處理后的生鮮黃魚(yú)片剪碎,每小塊約(5±1) g,分別放入100 mL離心管中,加入50 mL去離子水,高速勻漿30 s。制得的勻漿液在10000 r/min、4 ℃條件下離心15 min后,取上清,定容至100 mL,取80 mL用于電子舌分析。樣品測(cè)量的循環(huán)次數(shù)為4次,取后3次數(shù)據(jù)用于主成分分析(PCA)[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)三次,數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SAS 8.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),差異顯著性選擇鄧肯多重比較檢驗(yàn),P<0.05為差異顯著。采用Origin 8.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAW性質(zhì)的測(cè)定

2.1.1 PAW抗菌活性及抗菌時(shí)效的測(cè)定 如圖2所示,在恒定的處理電壓及頻率條件下,隨著等離子體射流裝置處理時(shí)間的增加(儲(chǔ)藏時(shí)間為0 h),PAW的抗菌活性顯著增強(qiáng)(P<0.05)。經(jīng)等離子體射流裝置處理1、2和3 min后,得到的PAW能使腸炎沙門(mén)氏菌的菌落數(shù)從原始的7.76lg CFU/mL(去離子水處理)分別降至7.21lg、5.81lg和4.72lg CFU/mL,分別降低了0.55lg、1.95lg和3.04lg CFU/mL(殺菌率分別為71.82%、98.88%和99.91%)。由此可見(jiàn),PAW對(duì)食源性致病菌具有較好的抗菌作用,能夠顯著(P<0.05)降低菌落數(shù),適合用于生鮮肉的清洗。等離子體活性水作為一種新型的抗菌液,具備抗菌效果的同時(shí)也應(yīng)有一定的穩(wěn)定性。從圖2中可知,PAW-1儲(chǔ)藏至4 h時(shí),其抗菌性能與去離子水處理相比無(wú)顯著性差異,相比之下,PAW-3仍保持較好的抗菌性能,表明等離子體射流處理的時(shí)間越長(zhǎng),PAW的抗菌時(shí)效越長(zhǎng),且PAW的抗菌性能最高能夠保持8 h。

圖2 等離子體活性水對(duì)菌落數(shù)的影響Fig.2 Effects of plasma-activated wateron the number of live bacterium

圖3 等離子體活性水中長(zhǎng)效物質(zhì)的測(cè)定 Fig.3 Detection of long-lived species in plasma-activated water 注:小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05),圖5～圖8同。

綜上可知,隨著等離子體處理時(shí)間的延長(zhǎng),PAW中的抗菌活性物質(zhì)含量能夠增加;PAW中的過(guò)氧化氫與亞硝酸根反應(yīng)形成的ONOOH雖具有較強(qiáng)的抗菌性能,但由于其化學(xué)性質(zhì)的不穩(wěn)定,抗菌時(shí)效很短;PAW儲(chǔ)藏過(guò)程中的抗菌性能主要?dú)w因于亞硝酸根在酸性條件下分解形成的具有較強(qiáng)殺菌活性的NO·和NO2·。因此,PAW的抗菌性能相對(duì)穩(wěn)定,并非是瞬時(shí)性的,對(duì)于產(chǎn)業(yè)應(yīng)用具有一定的可行性。

2.2 PAW處理對(duì)生鮮黃魚(yú)品質(zhì)的影響

2.2.1 PAW對(duì)生鮮黃魚(yú)的抗菌效果 如圖4所示,經(jīng)PAW處理后,黃魚(yú)表面腸炎沙門(mén)氏菌的活菌數(shù)量顯著降低(P<0.05),且隨著等離子體射流處理水時(shí)間的增加,其抗菌效果顯著(P<0.05)增加。經(jīng)PAW-1、PAW-2和PAW-3浸泡后,黃魚(yú)表面的沙門(mén)氏菌數(shù)從5.26lg CFU/g(去離子水處理)分別降低至5.15lg、4.98lg和4.14lg CFU/g,其中PAW-3抗菌效果最顯著(P<0.05),可使黃魚(yú)表面沙門(mén)氏菌細(xì)菌數(shù)降低1.12lg CFU/g,殺菌率達(dá)92.41%,因魚(yú)肉組織結(jié)構(gòu)的影響,殺菌率略低于純菌液的殺菌效果。經(jīng)去離子水、PAW-1、PAW-2和PAW-3處理后的魚(yú)片在4 ℃條件下儲(chǔ)藏24 h后,黃魚(yú)表面的沙門(mén)氏菌菌落數(shù)分別為6.21lg、6.07lg、5.78lg和5.49lg CFU/g,表明等離子體活性水中的抗菌物質(zhì)(酸性亞硝酸鹽:NO·、NO2·)能夠有效地抑制魚(yú)肉儲(chǔ)藏過(guò)程中微生物的生長(zhǎng)。綜上可知,魚(yú)肉經(jīng)過(guò)PAW簡(jiǎn)單的浸泡便可實(shí)現(xiàn)快速高效的殺菌效果,更利于魚(yú)肉的儲(chǔ)藏。

圖4 不同等離子體活性水對(duì)菌落數(shù)的影響 Fig.4 Effects of various types of PAWon the number of live bacterium

2.2.2 PAW對(duì)生鮮黃魚(yú)色澤的影響 肉的顏色是消費(fèi)者用來(lái)評(píng)判肉質(zhì)量及新鮮度的重要指標(biāo)[30],本文利用色差儀測(cè)定經(jīng)PAW浸泡后生鮮黃魚(yú)片的表面色澤。表1表明,經(jīng)PAW浸泡后,魚(yú)肉的L*和a*值降低,b*值增加,但與對(duì)照組相比并無(wú)顯著性差異(P>0.05)。由此表明,PAW不會(huì)引起魚(yú)肉的肉色發(fā)生顯著變化。

表1 不同等離子體活性水處理對(duì)黃魚(yú)表面色澤的影響Table 1 Effects of various types of PAWon the surface color of yellow croaker

2.2.3 PAW對(duì)生鮮黃魚(yú)pH的影響 圖5為不同PAW處理對(duì)黃魚(yú)pH的影響,從圖5中可以看出,PAW處理對(duì)魚(yú)肉pH的影響較小。PAW-3 浸泡后的魚(yú)肉,其pH從6.54降低至6.45,表明魚(yú)片經(jīng)PAW浸泡處理后,PAW本身的低pH特性并不會(huì)影響魚(yú)肉的pH。同時(shí)由于魚(yú)肉本身呈酸性[31],pH6.45并不會(huì)顯著影響肉的品質(zhì),同時(shí)低pH的環(huán)境能抑制微生物的生長(zhǎng)。

圖5 不同等離子體活性水對(duì)黃魚(yú)pH的影響Fig.5 Effect of various types of PAWon the pH of yellow croaker

2.2.4 PAW對(duì)生鮮黃魚(yú)TBARS值的影響 等離子體中的長(zhǎng)效物質(zhì)或者自由基可通過(guò)從脂質(zhì)分子中提取氫離子開(kāi)啟脂質(zhì)氧化過(guò)程[32],Kim和孟婧怡等也指出豬肉經(jīng)等離子體處理后其脂質(zhì)氧化情況顯著增強(qiáng)[33-34]。本實(shí)驗(yàn)利用TBARS值評(píng)估不同種等離子體活性水(PAW-1,PAW-2,PAW-3)對(duì)魚(yú)肉脂質(zhì)氧化的影響。如圖6所示,隨著等離子體處理水時(shí)間的延長(zhǎng),魚(yú)肉中TBARS含量增加。當(dāng)?shù)入x子體射流處理水的時(shí)間增至3 min時(shí),魚(yú)肉的丙二醛含量從0.30增至0.34 mg/kg,表明此時(shí)等離子體活性水中的活性物質(zhì)或通過(guò)后續(xù)反應(yīng)形成的自由基,可能會(huì)破壞脂肪酸的功能,引起脂質(zhì)氧化[35]。Greene等指出當(dāng)鮮肉中的丙二醛含量在0.6 mg/kg以上時(shí)會(huì)對(duì)肉的感官品質(zhì)及風(fēng)味造成影響[36]。本實(shí)驗(yàn)中PAW處理后魚(yú)肉的丙二醛含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于該值,表明PAW浸泡不會(huì)對(duì)生鮮黃魚(yú)片的脂肪氧化產(chǎn)生影響。

圖6 不同等離子體活性水對(duì)黃魚(yú)TBARS值的影響Fig.6 Effect of various types of PAWon the TBARS values of yellow croaker

2.2.5 PAW對(duì)生鮮黃魚(yú)亞硝酸鹽含量的影響 本文通過(guò)檢測(cè)黃魚(yú)中亞硝酸鹽的含量來(lái)判斷PAW處理是否會(huì)造成過(guò)量的亞硝酸鹽殘留。如圖7所示,魚(yú)肉經(jīng)水及PAW-1、PAW-2和PAW-3處理后,魚(yú)肉的亞硝酸鹽含量分別為0.23、0.35、0.43和0.49 mg/kg,雖然PAW浸泡后黃魚(yú)中亞硝酸鹽的含量有所增加,但均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于限量值(30 mg/kg)[37],表明魚(yú)片經(jīng)PAW浸泡處理后,PAW中的部分亞硝酸根雖會(huì)吸附在魚(yú)片表面卻不會(huì)造成嚴(yán)重殘留,因此不會(huì)對(duì)人體健康造成危害。另外,在儲(chǔ)藏過(guò)程中,硝化還原菌的作用遠(yuǎn)弱于細(xì)菌亞硝酸鹽還原酶,亞硝酸鹽被還原為一氧化氮,導(dǎo)致亞硝酸鹽的減少的同時(shí)也能夠起到抗菌作用[38]。

圖7 不同等離子體活性水對(duì)黃魚(yú)亞硝酸鹽含量的影響Fig.7 Effect of various types of PAWon the nitrite content of yellow croaker

2.2.6 PAW對(duì)生鮮黃魚(yú)肌肉持水力的影響 魚(yú)體肌肉的持水力與其嫩度及質(zhì)構(gòu)等品質(zhì)密切相關(guān)[39],如圖8所示,經(jīng)去離子水及三種等離子體活性水處理后,魚(yú)肉的持水力分別為76.0%、75.1%、73.4%及72.9%。與去離子水處理組相比,等離子體活性水處理降低了魚(yú)肉的持水力,但并未產(chǎn)生顯著性差異,表明等離子體活性水中的氮氧自由基(NO·、NO2·)并不會(huì)對(duì)肌肉蛋白的空間結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重破壞,導(dǎo)致肌原纖維間隙中的水分的過(guò)量流失[40]。

圖8 不同等離子體活性水對(duì)黃魚(yú)肌肉持水力的影響Fig.8 Effect of various types of PAWon the water holding capacity of yellow croaker

2.2.7 PAW對(duì)生鮮黃魚(yú)氣味及味感的影響 如圖9A所示,兩個(gè)主成分PC1和PC2代表了電子鼻數(shù)據(jù)庫(kù)中89.5%的信息,且二維主成分分析(PCA)圖能較好地區(qū)分不同處理后魚(yú)肉的氣味。PC1解釋了傳感器響應(yīng)的主要差異,水、PAW-1、PAW-2和PAW-3處理組的樣品沿PC1軸依次排列,但并未過(guò)度分散,表明隨著等離子體處理時(shí)間的增加,等離子體活性水中的活性物質(zhì)會(huì)對(duì)魚(yú)肉的氣味造成影響,當(dāng)?shù)入x子體處理時(shí)間在3 min以內(nèi)時(shí)對(duì)魚(yú)肉氣味的影響并不顯著。

如圖9B所示,兩個(gè)主成分PC1和PC2代表了電子舌數(shù)據(jù)庫(kù)中75.8%的信息,因此可反映樣品的絕大部分信息。水、PAW-1、PAW-2和PAW-3處理組的數(shù)據(jù)點(diǎn)大部分出現(xiàn)重疊,并不能明顯地區(qū)分開(kāi),可見(jiàn)處理組之間的味感信息具有很大的相似性,表明魚(yú)片經(jīng)等離子體活性水浸泡后并不會(huì)對(duì)其味感產(chǎn)生顯著的影響。

圖9 不同等離子體活性水對(duì)黃魚(yú)(A)氣味及(B)味感的影響Fig.9 Effects of various types of PAWon the(A)odor and(B)taste of yellow croaker

3 結(jié)論