毛劍琴，袁德培*，張譽(yù)丹，覃 亞

1.湖北民族大學(xué)(湖北 恩施 445000) 2.湖北民族大學(xué)風(fēng)濕病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點實驗室(湖北 恩施 445000)

阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種最常見的神經(jīng)退行性疾病，占癡呆癥的50%～75%，目前仍無法治愈?；颊叨喑霈F(xiàn)記憶障礙，認(rèn)知功能下降，行為障礙及生活能力障礙等臨床表現(xiàn)。其病因尚不明確，病機(jī)假說有多種，涉及Aβ假說、tau蛋白異常磷酸化假說、神經(jīng)元凋亡假說、自由基損傷假說、免疫異常假說、基因突變假說、膽堿能損傷假說、金屬離子代謝紊亂、內(nèi)分泌失調(diào)假說等理論[1]。相關(guān)流行病學(xué)研究顯示[2]，全球AD患者已達(dá)4 680萬，且呈上升趨勢，因此，如何有效的防治AD意義重大。固本健腦液是基于老年性癡呆“脾腎虧虛、腦髓失養(yǎng)、兼有痰瘀”的中醫(yī)病理假說，結(jié)合多年臨床研究研制的醫(yī)院制劑，具有培固后天之本，補(bǔ)脾益腎，健腦醒神，兼化痰瘀之功效，亦有研究證實，固本健腦液能有效改善AD患者的臨床癥狀[3]。目前對此方治療AD的作用靶點和機(jī)制尚未明確，仍需進(jìn)一步研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，融合多向藥理學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)思想，闡述靶標(biāo)與疾病網(wǎng)絡(luò)之間的協(xié)同效應(yīng)和潛在機(jī)制。本研究以固本健腦液為對象，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，構(gòu)建“成分-靶點-通路-機(jī)制-AD”網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步闡述固本健腦液防治AD多成分、多靶點和多通路的特點，為拓寬固本健腦液臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)；人類孟德爾遺傳(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org/)；Pubmed數(shù)據(jù)庫(http://pubmed.cn)；TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；UltraEdit軟件；Cytoscape3.7.1 軟件；string數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)；Bioconductor數(shù)據(jù)庫(http://http://bioconductor.org)；R軟件；Perl軟件。

1.2方法

1.2.1 固本健腦液化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的構(gòu)建 以固本健腦液中五味中藥(黨參、茯苓、酸棗仁、山楂、枸杞)為關(guān)鍵詞，基于數(shù)據(jù)庫樣本數(shù)據(jù)復(fù)雜性與TCMSP用戶指南，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18為篩選條件，檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取固本健腦液各藥物成分的化學(xué)信息和關(guān)鍵靶點信息。

1.2.2 AD靶蛋白的收集及前處理 GeneCards數(shù)據(jù)庫keywords中輸入“alzheimer’s disease”進(jìn)行檢索，所得信息輸出為Excel；打開OMIM數(shù)據(jù)庫，在Advanced Search一欄中選GeneMap，再檢索alzheimer’s diseae，待搜索完畢，download為Excel格式。

1.2.3 固本健腦液-AD靶蛋白交集的整理 整理出固本健腦液的潛在靶蛋白與AD相關(guān)靶蛋白，分別形成drug.txt和disease.txt兩個文件，在R軟件中安裝"VennDiagram"數(shù)據(jù)包，用UltraEdit軟件編寫整理出靶蛋白交集的腳本，在R中運行，輸出靶蛋白交集，為drug.disease.txt，并構(gòu)成Venn圖。

1.2.4 固本健腦液“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network,PPI network)的構(gòu)建與評估 根據(jù)中藥成分、靶點之間的關(guān)系，建立活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，采用Cytoscape 3.7.1進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化，并在R中用barplot函數(shù)繪制核心蛋白靶點的柱狀圖。根據(jù)1.2.3中得到的drug.disease.txt，檢索string數(shù)據(jù)庫，在Multiple proteins右邊輸入所有靶蛋白，在Organism下方選擇Homo sapiens進(jìn)行搜索，隱去孤立的蛋白靶點，以minimum required interaction score=0.4為評判標(biāo)準(zhǔn)，從而得到固本健腦液防治AD關(guān)鍵靶點之間的相互作用關(guān)系。

1.2.5 對關(guān)鍵靶蛋白進(jìn)行GO和KEGG富集分析 根據(jù)1.2.3中得到的drug.disease.txt，在Bioconductor中找到"DOSE"、"clusterProfiler"、"pathview"3個安裝包，在R中運行安裝。之后用UltraEdit編輯運行GO和KEGG的腳本，在R中運行，得到GO分析的柱狀圖、散點圖和數(shù)據(jù)結(jié)果，得到KEGG的柱狀圖、散點圖、通路圖和相關(guān)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1固本健腦液化學(xué)成分和靶蛋白通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到固本健腦液化合物217個。以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為篩選條件，篩選得到固本健腦液活性化學(xué)成分76種，見表1。

表1 固本健腦液候選活性成分表

MOL001979LAN42.120.75MOL000449Stigmasterol43.830.76MOL000358beta-sitosterol36.910.75MOL005406atropine45.970.19MOL005438campesterol37.580.71MOL006209cyanin47.420.76MOL00744924-methylidenelophenol44.190.75MOL008173daucosterol_qt36.910.75MOL008400glycitein50.480.24MOL010234delta-Carotene31.800.55MOL000953CLR37.870.68MOL00960414b-pregnane34.780.34MOL00961524-Methylenecycloartan-3beta,21-diol37.320.80MOL00961724-ethylcholest-22-enol37.090.75MOL00961824-ethylcholesta-5,22-dienol43.830.76MOL00962024-methyl-31-norlanost-9(11)-enol38.000.75MOL00962124-methylenelanost-8-enol42.370.77MOL009622Fucosterol43.780.76MOL00963131-Norcyclolaudenol38.680.81MOL00963331-norlanost-9(11)-enol38.350.72MOL00963431-norlanosterol42.200.73MOL0096354,24-methyllophenol37.830.75MOL009639Lophenol38.130.20MOL0096404alpha,14alpha,24-trimethylcholesta-8,24-dienol38.910.76MOL0096414alpha,24-dimethylcholesta-7,24-di-enol42.650.75MOL0096424alpha-methyl-24-ethylcholesta-7,24-dienol42.300.78MOL0096446-Fluoroindole-7-Dehydrocholesterol43.670.72MOL0096467-O-Methylluteolin-6-C-beta-glucoside_qt40.770.30MOL009650Atropine42.160.19MOL009651Cryptoxanthinmonoepoxide46.950.56MOL009653Cycloeucalenol39.730.79MOL009656(E,E)-1-ethyloctadeca-3,13-dien-oate42.000.19MOL009662LantadeneA38.680.57MOL009664PhysalinA91.790.27MOL009665Physcion-8-O-beta-D-gentiobioside42.900.62MOL009677lanost-8-en-3beta-ol34.230.74MOL009678lanost-8-enol34.230.74MOL009681Obtusifoliol42.550.76MOL000098quercetin46.430.28

2.2固本健腦液-PBC靶點交集檢索固本健腦液相關(guān)靶點共2 920種，排除重復(fù)靶點和與76種有效成分無關(guān)靶點后，得到695種。經(jīng)GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索，與AD相關(guān)靶點共有7 600個；經(jīng)OMIM檢索，與AD相關(guān)靶點有95個。兩個數(shù)據(jù)庫靶點匯合，排除重復(fù)靶點，共得到7 690個靶點。通過在線Venn圖得到藥物和疾病共同的靶點459個，即固本健腦液防治AD的關(guān)鍵靶點，見圖1。

圖1 固本健腦液-AD靶點交集Venn圖

2.3固本健腦液“成分-靶蛋白-通路”網(wǎng)絡(luò)與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的建立

2.3.1 化合物-靶蛋白網(wǎng)絡(luò)分析 運用Cytoscape3.7.1將中藥、中藥主要化學(xué)成分、關(guān)鍵靶蛋白與疾病關(guān)系可視化，如圖2所示，紅色為疾病(AD)，綠色為中藥名(固本健腦液)，黃色為中藥主要化學(xué)成分，藍(lán)色為關(guān)鍵靶點。

圖2 中藥-化學(xué)成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3.2 PPI網(wǎng)絡(luò) 查詢String數(shù)據(jù)庫，將459個關(guān)鍵靶點蛋白進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)可視化，如圖3所示。其中TP53、AKT1、JUN、TNF、HSP90AA1等靶點與較多的其他靶點相關(guān)聯(lián)，為核心靶點，見圖4。

圖3 固本健腦液防治AD靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 barplot函數(shù)核心蛋白圖

2.4GO分析與KEGG分析

2.4.1 GO分析結(jié)果 GO主要是進(jìn)行靶蛋白功能分析。通過運算，與關(guān)鍵靶蛋白相關(guān)功能共有302種。根據(jù)相關(guān)性分析，固本健腦液防治AD主要是通過影響機(jī)體的受體配體活性、輔因子結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性直接配體調(diào)節(jié)的序列特異性DNA結(jié)合等而發(fā)揮作用。如圖5，6所示，柱狀圖顏色越紅，說明相關(guān)性越高；點狀圖點越大，說明相關(guān)性越高。

圖5 GO分析結(jié)果柱狀圖

圖6 GO分析結(jié)果點狀圖

2.4.2 KEGG分析結(jié)果 通過關(guān)鍵蛋白在Bioconductor數(shù)據(jù)庫中，找到與之相關(guān)通路187條，根據(jù)通路中所含關(guān)鍵靶蛋白數(shù)目和相關(guān)性評分，排名前20條通路為固本健腦液防治AD的關(guān)鍵通路，如圖7和圖8所示，柱狀圖顏色越紅，說明相關(guān)性越高；點狀圖點越大，說明相關(guān)性越高。固本健腦液防治AD涉及前列腺癌信號通路、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染信號通路、人巨細(xì)胞病毒感染信號通路、鈣信號通路、癌癥中的蛋白聚糖信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路、IL-17信號通路、乙型肝炎信號通路、恰加斯病信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性信號通路、非酒精性脂肪肝信號通路、內(nèi)分泌阻力信號通路、細(xì)胞衰老信號通路、丙型肝炎信號通路、胰腺癌細(xì)胞信號通路、膀胱癌信號通路、HIF-1信號通路、結(jié)腸直腸癌信號通路。其中人巨細(xì)胞病毒感染、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染為重要通路。圖9所示為Human cytomegalovirus infection信號通路，標(biāo)紅的為此通路中固本健腦液防治AD的重要靶蛋白，涉及TNF、PTGS2、GSK3B、RELA、EGFR、AKT1、CASP9、IL6、CASP3、NFKBIA、MDM2、BAX、CASP8、TP53、CASP8、CASP3等。

圖7 KEGG分析結(jié)果柱狀圖

圖8 KEGG分析結(jié)果散點圖

圖9 Human cytomegalovirus infection信號通路圖

3 討論

目前AD發(fā)病機(jī)制尚未明確，臨床治療存在一定難度。美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)的藥物只有兩類:膽堿酯酶抑制劑以及NMDA受體拮抗劑(美金剛)[4]，這兩種藥物只能一定程度上緩解AD的癥狀但并不能治愈AD。其他類型的藥物有許多仍在臨床實驗中,還有部分藥物由于多種原因已經(jīng)終止[5]?；谥嗅t(yī)藥理論和臨床實踐，AD病情進(jìn)展中固本健腦液治療病機(jī)可概括為氣虛→痰凝→血瘀→津停[6]，具有補(bǔ)脾益腎、化痰祛瘀、健腦益智等功效,契合AD病機(jī)。

“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)顯示IL-6、EGFR、NFKBIA、TNF、Fas、FADD、CASP8、BAX、CASP9、CASP3等靶點的Degree值排在前位，提示這些靶蛋白很可能在固本健腦液治療AD中的人巨細(xì)胞病毒感染信號通路中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Il-6主要由神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞組成，刺激小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥因子。Il-6通過增加神經(jīng)元APP mRNA的表達(dá)來增加APP的產(chǎn)生[7]。IL-6還通過誘導(dǎo)α2巨球蛋白的合成，抑制腦組織清除Aβ，導(dǎo)致腦組織Aβ的異常沉淀。TNF是通過抑制TNF誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥以促進(jìn)神經(jīng)元存活而成為AD的另一治療靶點[8]。TNFR1、TNF相關(guān)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體受體1(TRAIL1)和Fas都屬于死亡受體，TNF激活TNFR1后,TNFR1相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(TNFR1-associated death domain protein,TRADD)與胞內(nèi)的Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)和caspase 8相關(guān)聯(lián),形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物,能夠促進(jìn)procaspase 8成為其活性形式caspase 8,從而觸發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng),這個級聯(lián)反應(yīng)能夠激活下游的Caspase相關(guān)蛋白酶誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。另一方面，Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bax和Bak，使線粒體釋放Cyt C到胞漿從而引發(fā)Caspase-9前體及Caspase-3活化,后者剪切靶細(xì)胞的功能蛋白質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對固本健腦液多成分、多靶點、多通路的相互作用規(guī)律和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了挖掘和分析，通過建立藥效成分-靶點通路網(wǎng)絡(luò)圖，多角度探索固本健腦液防治AD潛在的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)固本健腦液中的灌木遠(yuǎn)志酮A、川芎哚、7，9(11)-去氫茯苓酸甲酯等活性成分可能通過抗感染、抗細(xì)胞凋亡、減少炎癥反應(yīng)等機(jī)制發(fā)揮治療AD的作用。為其后續(xù)臨床試驗療效評價指標(biāo)的篩選提供依據(jù)和方向。同時，對于文獻(xiàn)中證明有治療AD作用的部分化合物，本研究并未篩選得到，說明實驗方法還存在一些局限性，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果仍需要后續(xù)實驗的驗證與支持，并不斷完善。