高熳熳,焦新雅,張志勝,淑 英,饒偉麗,程書梅

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071001)

發(fā)酵肉制品是以各類畜禽肉為原料,采用微生物發(fā)酵技術(shù),原料肉經(jīng)特定的微生物作用,產(chǎn)酸使pH下降,并經(jīng)過低溫失水使產(chǎn)品的AW降低,從而延長產(chǎn)品貯藏期的一大類肉制品[1-2]。近年來,發(fā)酵肉制品因其具有獨(dú)特的感官性質(zhì)和豐富的營養(yǎng)價(jià)值,并且有利于消化吸收,貨架期較長等優(yōu)點(diǎn),越來越受廣大人民的歡迎。但由于其生產(chǎn)周期長,工業(yè)化生產(chǎn)的規(guī)模受到限制,價(jià)格昂貴,不能滿足日益增長的市場(chǎng)需求[3]。因此,篩選用于發(fā)酵肉制品的乳酸菌株,對(duì)于縮短發(fā)酵肉制品生產(chǎn)周期,實(shí)現(xiàn)商業(yè)化具有重要意義。

侗族是中國少數(shù)民族之一,其制作的傳統(tǒng)發(fā)酵酸肉營養(yǎng)豐富,風(fēng)味獨(dú)特,保存期長[4-5]。而乳酸菌在其自然發(fā)酵過程中發(fā)揮了重要作用,一方面它能將原料中的碳水化合物分解為乳酸,使產(chǎn)品的pH下降,有效抑制雜菌的生長[6-8];另一方面,它賦予了產(chǎn)品特有的風(fēng)味、色澤和質(zhì)地,因此其常被篩選出來用作肉品發(fā)酵劑[9]。例如章德法等人在侗族酸肉中篩選出兩株戊糖片球菌,一株德氏乳桿菌和一株米酒乳桿菌[10];董競(jìng)等人在侗族酸肉中篩選出兩株肉葡萄球菌[4]。而從侗族酸肉中篩選出香腸乳桿菌較為少見。

乳酸菌是益生菌中應(yīng)用最為廣泛的菌種之一。大量文獻(xiàn)證明,使用乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵是可行的,安全的。但也有少量研究結(jié)果表明能夠從心內(nèi)膜炎患者[11-12]、敗血癥[13-14]、肝膿腫[15-16]和尿路感染病人體內(nèi)分離出乳酸菌,因此對(duì)新篩選出的可作為益生菌的乳酸菌進(jìn)行安全性的評(píng)價(jià)是必要的,尤其是對(duì)于食品用的菌株[17]。

在益生菌的安全性評(píng)價(jià)中,一個(gè)非常重要的方面就是耐藥性,研究認(rèn)為乳酸菌中絕大多數(shù)的抗生素耐藥性是一種非轉(zhuǎn)移特性,然而與結(jié)合質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子相關(guān)的耐藥性因子有可能引起耐藥性在腸道菌群之間相互轉(zhuǎn)移。因此,對(duì)于食品用乳酸菌進(jìn)行質(zhì)粒檢測(cè)可有效減低菌株作為耐藥性基因貯存宿主的風(fēng)險(xiǎn);溶血現(xiàn)象的發(fā)生可能是由于溶血性細(xì)菌引起的,乳酸菌有可能是潛在的溶血性細(xì)菌,導(dǎo)致敗血癥的發(fā)生。

本試驗(yàn)從侗族傳統(tǒng)發(fā)酵酸肉中分離純化得到乳酸菌菌株,并從中選出適合發(fā)酵肉類生產(chǎn)的優(yōu)良菌種,進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察以及16S rRNA遺傳學(xué)鑒定,對(duì)其發(fā)酵特性和生長特性以及其安全性進(jìn)行評(píng)估,以期為新型健康發(fā)酵肉制品的研究和開發(fā)提供優(yōu)質(zhì)菌種資源[18]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

侗族傳統(tǒng)發(fā)酵酸肉 保定大賣園超市(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)店);31516KC4細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 美國AXYGEN公司;RR001EX Taq酶、BK6501AdNTP、AB5401A10×EX Taq Buffer 大連TaKaRa公司;引物 生工生物工程上海(股份)有限公司;DL2000 Marker 北京博邁德生物技術(shù)有限公司;頭孢噻肟(Cefotaxime)、頭孢氨芐(Cephalexin)、氨卡西林(Ampicillin)、卡那霉素(Kanamycin)、慶大霉素(Gentamycin)、新霉素(Neomycin)、鏈霉素(Streptomycin)、四環(huán)素(Tetracycline)、紅霉素(Erythromycin)、萬古霉素(Vancomycin)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)、左氧氟沙星(Evofloxacin)、阿莫西林(Amoxicillin) 深圳康泰生物制品股份有限公司;血平板 廣東環(huán)凱生物科技有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒(Easy Pure Plasmid Miniprep Kit) 北京全式金生物技術(shù)有限公司。

SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;LD5-2A低速離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司;FA2204B電子天平 上海天美天平儀器有限公司;1-15PK高速離心機(jī) 德國西格瑪公司;XZQ-X300數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱 常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司;Nikon YS100顯微鏡 尼康映像儀器銷售(中國)有限公司;JY04S-3C凝膠成像儀、JY300C電泳系統(tǒng) 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;MG96+PCR儀 杭州朗基科學(xué)儀器有限公司;625-0020 3730XL 測(cè)序儀 Applied Biosystems。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 MRS培養(yǎng)基、產(chǎn)粘性培養(yǎng)基、耐鹽性試驗(yàn)培養(yǎng)基、耐硝性試驗(yàn)培養(yǎng)基、產(chǎn)H2S培養(yǎng)基、葡萄糖產(chǎn)氣培養(yǎng)基、氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基、硝酸鹽還原培養(yǎng)基、產(chǎn)氨培養(yǎng)基、乳酸紙層析試劑、石蕊牛乳培養(yǎng)基、V-P反應(yīng)培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[18-21]進(jìn)行配制。

1.2.2 樣品處理 在無菌條件下取侗族酸肉樣品25 g,切碎,加入到225 mL的無菌生理鹽水中,振蕩均勻備用。取1.0 mL加至到9.0 mL無菌生理鹽水中進(jìn)行梯度稀釋。

1.2.3 乳酸菌的分離 選取合適的稀釋度,涂布于含3% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基上,凝固后置于37 ℃培養(yǎng)。挑取產(chǎn)生碳酸鈣溶解圈的單菌落反復(fù)劃線,直至獲得純的菌株。對(duì)純菌株進(jìn)行革蘭氏染色、菌體形態(tài)觀察、過氧化氫酶活性測(cè)定,凡是革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗(yàn)陰性的菌株初步確定為乳酸菌[22-23]。

1.2.4 優(yōu)良乳酸菌的篩選 對(duì)分離得到的乳酸菌按照以下方法進(jìn)行篩選:產(chǎn)黏性試驗(yàn)、耐鹽性試驗(yàn)、耐硝性試驗(yàn)、產(chǎn)H2S試驗(yàn)、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)、氨基酸脫羧酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原能力試驗(yàn)、產(chǎn)氨試驗(yàn)、乳酸的紙層析分析、石蕊牛乳試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、產(chǎn)酸性試驗(yàn)、抑菌試驗(yàn)、蛋白酶活性檢測(cè)和脂肪酶活性檢測(cè)參考湛劍龍等[24-27]。

1.2.5 乳酸菌的鑒定

1.2.5.1 形態(tài)特征觀察 將純化好的菌株利用平板劃線的方法接種于MRS培養(yǎng)基平板上,在37 ℃條件下恒溫培養(yǎng),觀察并記錄菌株的菌落形態(tài)。對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色,在光學(xué)顯微鏡下油鏡觀察并記錄待測(cè)菌株的菌體形態(tài)特征[28]。

1.2.5.2 生化鑒定 將分離得到的菌株于MRS液體培養(yǎng)基中活化后,按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[29]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[30]等文獻(xiàn)上的試驗(yàn)方法接入生化鑒定管,18～72 h后觀察記錄現(xiàn)象。

1.2.5.3 分子生物學(xué)鑒定 DNA的提取:分別用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對(duì)分離純化的細(xì)菌進(jìn)行提取,提取步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增及測(cè)序:PCR反應(yīng)體系(50 μL):10×Ex Taq buffer 5.0 μL,2.5 mmol/L dNTP Mix 4.0 μL,10p Primer 1 2.0 μL,10p Primer 22.0 μL,5u Ex Taq 0.5 μL,Template 2.0 μL,ddH2O 36.5 μL;反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s(24次循環(huán))。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),120 V,20 min,恒壓對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳,并在凝膠成像系統(tǒng)下觀察,并照相分析。將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。

序列分析:測(cè)序結(jié)果在NCBI利用Blast做相似性比對(duì)分析;另外,用ContigExpress軟件對(duì)序列進(jìn)行拼接及人工校正,生成Fasta格式文件,利用Mega 7軟件按照Neighbor-Joining法聚類構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。對(duì)得到的菌株進(jìn)行16S rRNA分子鑒定,鑒定委托生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.2.6 菌株產(chǎn)酸能力和生長曲線的測(cè)定 將分離菌株活化后接種于MRS液體培養(yǎng)基中,以空白培養(yǎng)基作對(duì)照,每隔2 h用分光光度計(jì)測(cè)定600 nm波長下各菌株菌液的OD值,并用酸度計(jì)測(cè)定pH。其OD值大小表示菌株的生長情況,pH可反應(yīng)出菌株的產(chǎn)酸能力。

1.2.7 菌株安全性分析

1.2.7.1 抗生素敏感性試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)采用藥敏紙片(直徑6.0 mm)瓊脂擴(kuò)散法[31],使用渦旋混勻器混勻?qū)嶒?yàn)菌液,各取100 μL菌液涂布于MRS固體培養(yǎng)基上,待菌液被培養(yǎng)基完全吸收后,將藥敏紙片放于培養(yǎng)基上,靜置15 min后,倒置放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h,測(cè)量并記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑大小。結(jié)果判定參照《CLSI 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)》。

1.2.7.2 質(zhì)粒提取 參照質(zhì)粒提取試劑盒使用說明[32]。

1.2.7.3 溶血試驗(yàn) 將活化好的實(shí)驗(yàn)菌液劃線于血平板培養(yǎng)基上,倒置放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察是否出現(xiàn)溶血現(xiàn)象[33]。

1.2.8 三株菌的拮抗試驗(yàn) 將S26菌株在MRS固體培養(yǎng)基上劃一直線接菌,待長出菌落后,沿菌落邊緣(不接觸)從垂直方向接S42,37 ℃條件下培養(yǎng)24 h,觀察S26對(duì)于S42的抑制效果。同理,檢測(cè)S26對(duì)S53的抑制效果[34]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。采用Excel 2017軟件進(jìn)行繪圖和數(shù)據(jù)處理,SPSS 19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的初步分離純化

采用CaCO3-MRS固體培養(yǎng)基進(jìn)行乳酸菌的初步篩選,挑取具有明顯溶鈣圈的菌落進(jìn)行反復(fù)純化,在經(jīng)革蘭染色以及過氧化氫酶活性測(cè)定后,得到G+、過氧化氫酶試驗(yàn)陰性的疑似乳酸菌共54株,分別命名為S1～S54。

2.2 優(yōu)良乳酸菌株的篩選結(jié)果

對(duì)初篩得到的54株乳酸菌按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行復(fù)篩:能夠耐受6%的NaCl和150 mg/kg NaNO2、不產(chǎn)粘液、發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣、不產(chǎn)H2S、不產(chǎn)氨、不具有氨基酸脫羧酶活性,產(chǎn)酸速度快,發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)物主要為乳酸,能抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌[26]等,其結(jié)果見表1。

表1 乳酸菌主要發(fā)酵特性陽性菌數(shù)Table 1 Number of positive fermentation characteristics of lactic acid bacteria

由表1可知,絕大部分菌株能耐受高濃度的NaCl和亞硝酸鹽;只有一株菌產(chǎn)粘液(1.85%);大部分能使牛奶酸凝(88%);54株乳酸菌都產(chǎn)酸,發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣,不生成H2S;大部分菌株不會(huì)發(fā)生氨基酸脫羧反應(yīng)(52%);多數(shù)菌株V-P反應(yīng)陽性(74%);大約一半菌株可抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長。最終結(jié)果表明,菌株S26、S42、S53能夠滿足所有篩選條件,且產(chǎn)酸性能較好,可以作為肉品發(fā)酵的備選菌株。

2.3 乳酸菌菌株鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)特征 從侗族傳統(tǒng)發(fā)酵酸肉中分離得到符合發(fā)酵條件的三株乳酸菌。其菌落形態(tài)和經(jīng)革蘭氏染色后的顯微形態(tài)詳見表2和圖1。

表2 三株菌的形態(tài)學(xué)特征Table 2 Morphological characteristics of three strains

圖1 菌株S26、S42、S53革蘭氏染色顯微形態(tài)Fig.1 Gram staining micromorphology of strains S26,S42,S53

由表2和圖1可知,菌株S26為長桿菌,革蘭氏陽性,菌落呈乳黃色,扁平狀,菌落較小;菌株S42為短桿菌,革蘭氏陽性,菌落為乳白色,表面光滑,邊緣整齊;菌株S53為球形,菌落為乳白色,表面凸起,邊緣圓整。

2.3.2 生理生化結(jié)果 表3為三株菌的生理生化鑒定結(jié)果,結(jié)合三株菌的形態(tài)特征,根據(jù)文獻(xiàn)[30-31],可初步鑒定S26為香腸乳桿菌,S42為植物乳桿菌,S53為乳酸片球菌。

表3 生理生化鑒定結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical identification results

2.3.3 乳酸菌菌株的16S rRNA序列測(cè)定及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 對(duì)提取菌株的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增出3條大小約為1500 bp的特異性條帶。然后將獲得的特異性片段純化后進(jìn)行測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件在GenBank中進(jìn)行序列同源性比對(duì),將GenBank中與菌株序列同源性高于98%的幾株菌株進(jìn)行BLAST分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖2～圖5所示,S26為香腸乳桿菌(Lactobacillusfarciminis),S42為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),S53為乳酸片球菌(Pediococcuslactis)。

圖2 菌株的16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶Fig.2 16S rRNA PCR amplification productelectrophoresis band of the strain注:1:Marker標(biāo)記物;2～4:分別為菌株S26,S42,S53。

圖3 菌株S26系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain S26

圖4 菌株S42系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain S42

圖5 菌株S53系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain S53

2.4 菌株產(chǎn)酸能力和生長曲線的測(cè)定

將3株菌活化后接入到MRS培養(yǎng)基中,每間隔2 h取少量菌懸液,適當(dāng)稀釋后測(cè)定其OD值,同時(shí)測(cè)定其pH的變化規(guī)律,再分別繪制三株菌的生長曲線及pH變化曲線,圖6、圖7和圖8分別為香腸乳桿菌S26、植物乳桿菌S42、乳酸片球菌S53的生長曲線及pH變化曲線。

由圖6、圖7和圖8可知,3株菌的生長延滯期均為0～3 h,此時(shí)菌種處于適應(yīng)階段,生長緩慢;而香腸乳桿菌S26的對(duì)數(shù)生長期為3～10 h,植物乳桿菌S42的對(duì)數(shù)生長期為3～12 h,乳酸片球菌S53的對(duì)數(shù)生長期為3～16 h,此時(shí)菌種增殖較快;對(duì)于穩(wěn)定期,香腸乳桿菌S26在10 h后菌種進(jìn)入穩(wěn)定時(shí)期,植物乳桿菌S42在12 h后菌種進(jìn)入穩(wěn)定時(shí)期,乳酸片球菌S53在16 h后菌種進(jìn)入穩(wěn)定時(shí)期,此時(shí)OD值緩慢增長至最大并保持穩(wěn)定狀態(tài)。三株菌的pH均在對(duì)數(shù)生長期內(nèi)由5.7迅速下降至3.5左右,進(jìn)入穩(wěn)定期后變化不大。

圖6 香腸乳桿菌S26生長曲線及pH變化曲線Fig.6 Lactobacillus farciminis S26 growth curve and pH curve

圖7 植物乳桿菌S42生長曲線及pH變化曲線Fig.7 Lactobacillus plantarum S42 growth curve and pH curve

圖8 乳酸片球菌S53生長曲線及pH變化曲線Fig.8 Growth curve and pH curve of Pediococcus lactis S53

2.5 菌株的安全性分析

2.5.1 抗生素敏感性試驗(yàn) 采用藥敏片法檢測(cè)從酸肉中分離到的三株乳酸菌對(duì)13種抗生素的敏感性。被測(cè)菌株對(duì)抗生素的敏感性檢測(cè)結(jié)果如表4所示,香腸乳桿菌S26對(duì)這幾類抗生素均表現(xiàn)出敏感性;植物乳桿菌S42對(duì)糖肽類抗生素中的萬古霉素表現(xiàn)為耐藥,對(duì)其他類抗生素均有敏感性;乳酸片球菌S53對(duì)氨基糖苷類中的卡那霉素和喹諾酮類中的環(huán)丙沙星表現(xiàn)為耐藥,對(duì)其他抗生素均有敏感性。

表4 乳酸菌對(duì)13種抗生素的敏感性檢測(cè)結(jié)果Table 4 Sensitivity test results of lacticacid bacteria against 13 antibiotics

2.5.2 質(zhì)粒提取 通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)S26、S42和S53做質(zhì)粒檢測(cè),同時(shí)以含有質(zhì)粒的菌株(pET-22b)作對(duì)照,結(jié)果如圖9所示,對(duì)照菌株所在泳道出現(xiàn)熒光條帶,而被測(cè)菌株所在泳道均未出現(xiàn)熒光條帶,可認(rèn)定3株菌不含有質(zhì)粒。

圖9 質(zhì)粒提取試驗(yàn)結(jié)果Fig.9 Plasmid extraction test results

2.5.3 溶血現(xiàn)象 溶血性是體外對(duì)菌株進(jìn)行安全性檢測(cè)的重要指標(biāo)之一。根據(jù)溶血特征可將溶血性分為兩類:α溶血,特點(diǎn)是菌落周圍有草綠色溶血圈,對(duì)人致病力差;β溶血,其特點(diǎn)是菌落周圍出現(xiàn)透明溶血圈,對(duì)人體致病力強(qiáng)[35]。若無溶血性,則沒有溶血圈出現(xiàn)。由圖10可知,S26、S42和S53均無溶血現(xiàn)象產(chǎn)生,說明3株菌均不具有溶血性。

圖10 S26、S42和S53溶血試驗(yàn)結(jié)果Fig.10 S26,S42 and S53 hemolysis test results

2.6 菌株之間的拮抗試驗(yàn)

通過平板劃線可以比較菌株之間是否具有拮抗性,從而判斷菌株是否可以混合使用,由表5可知,S26、S42和S53之間均無拮抗性,可用來復(fù)配發(fā)酵。

表5 株菌拮抗效果比較Table 5 Comparison of antagonistic effects of strains

注:+代表拮抗,-代表不拮抗,/表示同種菌株不需要進(jìn)行拮抗性測(cè)試。

3 結(jié)論

從傳統(tǒng)侗族酸肉中篩選出能夠產(chǎn)生明顯透明鈣圈、革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的54株菌株,按照肉類發(fā)酵劑的篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步篩選得到3株發(fā)酵性能較好的菌株,并對(duì)其進(jìn)行分析鑒定,確定S26為香腸乳桿菌,S42為植物乳桿菌,S53為乳酸片球菌;對(duì)這3株菌的生長特性和產(chǎn)酸能力進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)這3株菌生長狀況良好,在12 h左右均能到達(dá)穩(wěn)定期,并且其產(chǎn)酸速度快,24 h內(nèi)可以將pH降到3.5左右;同時(shí)對(duì)這3株菌進(jìn)行了安全性方面的評(píng)估,發(fā)現(xiàn)其對(duì)大多數(shù)抗生素?zé)o耐藥性,無質(zhì)粒,也無溶血現(xiàn)象,安全性良好。這一研究結(jié)果將為肉制品以及功能性食品的研制等方面提供菌種資源。

本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中篩選出三株肉品發(fā)酵劑,其中香腸乳桿菌在肉品發(fā)酵劑方面未見報(bào)道;對(duì)這3株菌的具體功能方面應(yīng)在今后進(jìn)行更深一步的研究;此外,對(duì)這3株菌的發(fā)酵性能還應(yīng)實(shí)際應(yīng)用到肉制品發(fā)酵中進(jìn)行進(jìn)一步探究。