蘇健裕 管靖瑋 方立明 徐振波 肖雨茜

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640；2.華南理工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640)

自20世紀弗萊明發(fā)現(xiàn)盤尼西林以來，抗生素的濫用導(dǎo)致細菌的耐藥性不斷增加，已成為臨床醫(yī)學(xué)的棘手難題，開發(fā)新型抗菌材料、降低產(chǎn)生耐藥菌的風(fēng)險迫在眉睫[1]。檸檬醛是山蒼子精油中的主要抑菌成分，具有較好的廣譜抑菌性能[2- 3]，但易揮發(fā)和氧化變質(zhì)[4]。目前，研究者們大多采用微乳液[5]、微膠囊[6- 7]等包埋方法來提高檸檬醛的穩(wěn)定性，這能在一定程度上降低檸檬醛的揮發(fā)與變質(zhì)速率，但所制備的檸檬醛具有一定的時效性。金屬有機框架(MOF)化合物以金屬離子為中心，與有機配體通過化學(xué)配位構(gòu)建多孔三維框架結(jié)構(gòu)。MOF材料的 孔隙度高、比表面積大，其開放的金屬位點具有一定的抗菌能力[8- 10]?，F(xiàn)有研究中，尚未發(fā)現(xiàn)檸檬醛與金屬離子有增加細菌耐藥性的風(fēng)險，因此，MOF接枝檸檬醛有可能可以提高檸檬醛的穩(wěn)定性，同時結(jié)合MOF中金屬離子的抑菌能力，得到新型的高性能抗菌劑。IRMOF-3是以Zn4O6+為金屬位點、2-氨基對苯二甲酸為有機配體，通過水熱法或表面活性劑法合成的一種MOF。水熱法一般采用高溫長時反應(yīng)方式，反應(yīng)時間在24～72 h不等，且產(chǎn)物較少，多為微米級。添加表面活性劑的方法可加速晶體成核速度，反應(yīng)時間有所縮短(8～18 h)，但是反應(yīng)需要高溫，且產(chǎn)物粒徑分布不均勻，表面活性劑難去除。文中采用醋酸鋅法，在溫和條件下快速合成IRMOF-3。與水熱法和表面活性劑法比較，醋酸鋅法制備的IRMOF-3納米顆粒細小、均勻，晶體結(jié)構(gòu)完整。在此基礎(chǔ)上，通過可酸響應(yīng)的席夫堿鍵反應(yīng)，在IRMOF-3納米顆粒表面接枝檸檬醛(IRMOF-3-C)，以期合成具有良好抗菌性與穩(wěn)定性的抗菌劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檸檬醛(純度98%)、2-氨基對苯二甲酸(純度98%)、吡啶、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，均購自美國Sigma公司；六水合硝酸鋅(純度99%)，購自廣州化學(xué)試劑廠；二甲基亞砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(CH2Cl2)、甲醇、無水乙醇，購自天津大茂化學(xué)試劑廠；LB肉湯培養(yǎng)基、瓊脂粉，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；ATCC 23235金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、ATCC 43894大腸桿菌(Escherichiacoli)，來自American Type Culture Collection。

1.2 儀器設(shè)備

主要儀器設(shè)備如下：高分辨場發(fā)射掃描電子顯微鏡(德國Zeiss Merlin)、X射線多晶衍射儀(德國Bruker D8 ADVANCE)、傅里葉變換紅外光譜儀(德國Bruker VERTEX 70)、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(德國BrukerAgilent 1100/Esquire HCT PLUS)、同步熱分析儀(德國NETZSCH STA449 F3)、生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司LRH-250)、生物安全柜(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司HFsafe900)。

1.3 實驗方法

1.3.1 IRMOF-3的合成

根據(jù)文獻[11- 13]中的IRMOF-3合成方法，采用水熱法、表面活性劑法和醋酸鋅法分別制備了3種IRMOF-3。

水熱法：將二氨基對苯二甲酸(0.297 g，1.64 mmol)與六水合硝酸鋅(1.308 g，4.40 mmol)超聲溶解于80 mL DMF并轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜，在100 ℃下加熱18 h后冷卻，離心收集并用DMF洗滌3次后，用CH2Cl2置換DMF，每12 h換液1次，3 d后干燥。

表面活性劑法：將PVP(0.20 g)溶解于含有無水乙醇(5 mL)和DMF(5 mL)的混合溶劑中，然后將六水合硝酸鋅(66.93 mg)和二氨基對苯二甲酸(16.29 mg)溶解在4 mL的DMF中并加入上述溶液。將溶液超聲分散10 min后，轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中，并在105 ℃下加熱8 h(加熱速率1.5 ℃/min)。最后，通過離心(10 000 r/min，15 min)分離產(chǎn)物。產(chǎn)物用DMF反復(fù)洗滌5次后，放置于透析袋中80 ℃過夜去除未結(jié)合的有機配體和PVP。最后，用CH2Cl2置換DMF，12 h換液1次，3 d后干燥。

醋酸鋅法：將醋酸鋅(0.176 g，0.8 mmol)超聲分散于10 mL DMF中，2-氨基對苯二甲酸(0.054 g，0.3 mmol)超聲分散于15 mL DMF中。將2-氨基對苯二甲酸溶液置于磁力攪拌器上攪拌，并將醋酸鋅溶液快速倒入溶液中，攪拌反應(yīng)1 min，離心并用DMF洗滌3次，再用CH2Cl2置換DMF，每12 h換液1次，3 d后干燥。

以上3種合成方法的超聲和離心處理條件一致，超聲處理條件均為40 kHz、240 W，離心處理條件均為10 000 r/min、15 min；洗滌干燥條件均為：用CH2Cl2置換DMF，12 h換液1次，3 d后在25 ℃下真空干燥24 h。

1.3.2 IRMOF-3-C的合成

通過檸檬醛中的醛基與2-氨基對苯二甲酸中的氨基發(fā)生席夫堿反應(yīng)，將檸檬醛接枝在IRMOF-3顆粒表面，具體操作如下：將10 mg的IRMOF-3在10 mL的DMSO中進行超聲分散(40 kHz，240 W)，30 min后，加入檸檬醛(11.36 mg)、吡啶(0.1 mL)和DCC(20 mg)，在氮氣氣氛下避光，室溫攪拌4 h后離心(10 000 r/min，15 min)，收集產(chǎn)物并用DMF洗滌多次，再將其浸泡在CH2Cl2中，每12 h換液1次，置換3 d。

1.3.3 IRMOF-3-C的表征

(1)掃描電子顯微(SEM)表征[14]

SEM主要用來表征IRMOF-3以及IRMOF-3-C的表觀形貌。將制備好的顆粒在乙醇中超聲分散30 min(40 kHz，240 W)，選取適宜的濃度，取5 μL液體滴在光滑的硅片表面，干燥后噴金60 s制得電鏡樣品。

(2)X射線衍射表征(XRD)[15]

XRD主要用來表征IRMOF-3和IRMOF-3-C的晶型結(jié)構(gòu)。采用Cu靶Kα輻射，管壓40 kV，管流40 mA，掃描速度0.2°/s，采樣寬度0.02°，掃描范圍5°≤θ≤60°。測試前將樣品室溫真空干燥24 h后過200目篩。

(3)傅里葉紅外光譜(FT-IR)表征[16]

FT-IR主要用來表征材料接枝前后官能團的化學(xué)結(jié)構(gòu)變化。采用KBr壓片法進行測試，首先將IRMOF-3和IRMOF-3-C研磨至粉末狀，再分別與KBr以約1∶200的質(zhì)量比研磨至混合均勻，制得透明的固體KBr壓片用于測試。

(4)電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)表征[17]

ESI-MS用來進一步測定接枝是否成功。將IRMOF-3-C(10 mg)在3 mL含10 %甲醇的水溶液中超聲處理30 min(40 kHz，400 W)，過0.22 μm的濾膜，取1 mL過濾的上清液進行ESI-MS測定。

1.3.4 菌懸液的制備[18]

將凍存的大腸桿菌與金黃色葡萄球菌在LB液體培養(yǎng)基中接種過夜，培養(yǎng)活化菌株，將菌株轉(zhuǎn)移到LB固體培養(yǎng)基上畫板培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種在LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，離心(5 000 r/min，5 min)后用生理鹽水洗滌、重懸，調(diào)整到與0.5麥氏比濁管相同的濁度(約為1.5×108CFU/mL)使用。

1.3.5 最小抑菌濃度的測定[19]

最小抑菌濃度(MIC)是指在藥物作用于細菌后能完全抑制細菌生長的最低濃度。將在LB液體培養(yǎng)基中分散好的檸檬醛、IRMOF-3與IRMOF-3-C在96孔板中進行二倍稀釋，并加入稀釋好的菌液使每個孔中的菌濃度為1×105CFU/mL，制備梯度材料濃度(4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.063、0.031 mg/mL)的樣品，將其放置在37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，測600 nm處的吸光度(OD600)來判定MIC。設(shè)置只有菌的陰性對照組、無菌的空白對照組與只加材料的對照組。

1.3.6 最小殺菌濃度的測定[20]

最小殺菌濃度(MBC)表示與陽性對照(未處理)相比，殺滅99.9%的細菌所需的最小顆粒濃度。通過將MIC菌液培養(yǎng)在LB固體培養(yǎng)基上，并在37 ℃下孵育24 h來測定MBC值。所有測定均在生物安全柜中進行。

1.3.7 細菌形態(tài)的觀察

將經(jīng)過2倍MIC的IRMOF-3-C處理的菌液(實驗組)和生理鹽水(對照組)處理后的菌液于4 000 r/min下離心5 min，棄上清液，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌兩次除去殘留的培養(yǎng)基后，加入用PBS稀釋的含2.5%戊二醛的溶液，于4 ℃固定12 h，再用PBS溶液洗滌兩次。分別用30%、50%、70%、85%、90%、95%梯度濃度的乙醇脫水，每個梯度中靜置5 min，再用100%乙醇脫水兩次，每次靜置15 min。將細菌真空干燥并噴金60 s后，用場發(fā)射電鏡觀察細菌形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 IRMOF-3與IRMOF-3-C的形貌分析

研究中采用了3種方法來合成IRMOF-3并進行形貌分析。水熱法合成的IRMOF-3(如圖1(a)所示)顆粒粒徑約為12～18 μm，結(jié)構(gòu)基本規(guī)整，大體呈六面體，棱角分明。但是，由于在靜止條件下長時間高溫加熱反應(yīng)，晶核形成時間長，導(dǎo)致粒徑偏大、尺寸分布不均勻。加入表面活性劑PVP并采用高溫法合成IRMOF-3(如圖1(b)所示)可以加速成核，縮短反應(yīng)時間，得到較小的粒徑(約為200～600 nm)。然而，表面活性劑的加入會影響顆粒形貌，導(dǎo)致顆粒呈球狀。采用醋酸鋅為鋅源，在室溫攪拌下合成IRMOF-3(如圖1(c)所示)時，由于醋酸鋅可以加速2-氨基對苯二甲酸的去質(zhì)子化，加快成核速度，所以能在室溫、攪拌等簡單條件下快速合成得到粒徑50 nm左右的六面體顆粒，且粒徑均一，表面平整。因此，可選擇醋酸鋅法合成IRMOF-3納米顆粒，并在其表面接枝檸檬醛。圖1(d)顯示，接枝后的顆粒表面形貌較接枝前沒有顯著區(qū)別，保持了原有的粒徑大小與六面體結(jié)構(gòu)。

圖1 IRMOF-3與IRMOF-3-C的SEM圖Fig.1 SEM images of IRMOF-3 and IRMOF-3-C

2.2 IRMOF-3與IRMOF-3-C的晶型分析

采用XRD對水熱法、表面活性劑法和醋酸鋅法合成的IRMOF-3進行了晶體學(xué)研究，結(jié)果見圖2。可以看出，3種方法合成的顆粒的晶型與模擬的IRMOF-3的出峰位置基本相同，表明其晶型結(jié)構(gòu)一致。接枝檸檬醛后，IRMOF-3-C的XRD出峰位置基本無變化，表明接枝檸檬醛的過程中溶劑與催化劑未破壞IRMOF-3的晶型結(jié)構(gòu)。

圖2 IRMOF-3與IRMOF-3-C的XRD圖譜Fig.2 XRD patterns of IRMOF-3 and IRMOF-3-C

2.3 IRMOF-3與IRMOF-3-C的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

圖3 IRMOF-3與IRMOF-3-C的紅外譜圖Fig.3 FT-IR spectra of IRMOF-3 and IRMOF-3-C

圖4 IRMOF-3-C的電噴霧質(zhì)譜圖Fig.4 ESI-MS spectrum of IRMOF-3-C

圖5 室溫放置7 d后IRMOF-3-C的電噴霧質(zhì)譜圖

Fig.5 ESI-MS spectrum of IRMOF-3-C after stored for 7 days at room temperature

2.4 抗菌性能

選擇大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)與金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)為實驗菌株來評價檸檬醛、IRMOF-3與IRMOF-3-C的抗菌性能，結(jié)果(見圖6和7)顯示，與檸檬醛相比，IRMOF-3-C表現(xiàn)出較強的抑菌能力，這主要是因為檸檬醛不溶于水，在水中分散性極差且易揮發(fā)，影響了其抗菌能力。而IRMOF-3-C通過席夫堿鍵接枝檸檬醛，增加了檸檬醛的分散性，并且席夫堿鍵對酸敏感，可以在酸性環(huán)境下斷裂，使得檸檬醛中的醛基從IRMOF-3上恢復(fù)并釋放。細菌的生長會形成微酸環(huán)境[19,21]，在抗菌過程中IRMOF-3-C一方面通過酸響應(yīng)釋放檸檬醛抗菌，另一方面通過Zn2+的金屬位點抗菌[14,22]，從而增強了抗菌效果。細菌在IRMOF-3-C溶液中培養(yǎng)12 h后的SEM形貌觀察結(jié)果也顯示，大腸桿菌的菌體凹陷結(jié)構(gòu)坍塌細胞壁被破壞(見圖8(a))，金黃色葡萄球菌的菌體也呈干癟狀態(tài)且細胞壁表面出現(xiàn)明顯的裂痕(見圖8(b))；反之，與在生理鹽水中培養(yǎng)的細菌對照(見圖8(a)和8(b)右下角插圖)，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均呈飽滿的形態(tài)，表面的細胞壁致密無裂痕。據(jù)此推斷，在細菌培養(yǎng)環(huán)境下，檸檬醛與Zn2+從IRMOF-3-C上釋放，兩者作用于細菌細胞壁，使其破損而起到殺菌作用(如圖9所示)。而IRMOF-3-C抗金黃色葡萄球菌的效果低于大腸桿菌，是因為革蘭氏陽性菌的細胞壁較厚、組織緊密堅固，而檸檬醛與金屬離子是通過破壞細胞壁來發(fā)揮殺菌作用[23- 25]所致。

圖6 檸檬醛、IRMOF-3與IRMOF-3-C對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的OD600測定結(jié)果

Fig.6 OD600values of citral,IRMOF-3 and IRMOF-3-C againstEscherichiacoliandStaphylococcusaureus

圖7 檸檬醛、IRMOF-3與IRMOF-3-C對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的MBC測定

Fig.7 MBC determination of citral,IRMOF-3 and IRMOF-3-C againstEscherichiacoliandStaphylococcusaureus

圖8 大腸桿菌與金黃色葡萄球菌在IRMOF-3-C和生理鹽水中培養(yǎng)12 h后的SEM照片1)

Fig.8 SEM images ofEscherichiacoliandStaphylococcusaureusafter being cultured in IRMOF-3-C and saline solutions for 12 h,respectively

1)各小圖右下角插圖為在生理鹽水中培養(yǎng)12 h后的照片

圖9 IRMOF-3 接枝檸檬醛的抗菌機理示意圖

Fig.9 Schematic drawing of the antibacterial mechanism of IRMOF-3 grafted with citral

3 結(jié)語

文中探討了水熱法、表面活性劑法與醋酸鋅法合成的IRMOF-3顆粒的形貌結(jié)構(gòu)，并采用醋酸鋅法一步合成了納米級的IRMOF-3。利用檸檬醛上的醛基與IRMOF-3的有機配體2-氨基對苯二甲酸上的氨基發(fā)生的席夫堿反應(yīng)，形成了具有酸響應(yīng)功能的席夫堿鍵，提高了檸檬醛的穩(wěn)定性。金黃色葡萄球菌與大腸桿菌的MIC與MBC測試結(jié)果顯示，IRMOF-3-C的抗菌效果優(yōu)于IRMOF-3，這可能是由于細菌生長的微酸環(huán)境導(dǎo)致席夫堿鍵斷裂，釋放出檸檬醛，從而提高了材料的抗菌性。文中結(jié)果為改善檸檬醛穩(wěn)定性、提高其抗菌適用性以及研發(fā)高性能抗菌材料提供了新的思路。