陳慎 黃穎穎 陸東和

摘 要：為明確海帶對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性的抑制作用，通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗，探討不同纖維素酶添加量和酶解時間對海帶漿抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性的影響。結(jié)果表明：采用纖維素酶對海帶漿進行酶解，建立了海帶酶解液血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）活性抑制率Y與纖維素酶添加量X1、酶解時間X2的數(shù)學(xué)模型：Y=-114.27304+0.00572X1+1.49199X2-3.33333×10-7X1X2-2.55200×10-7X12-0.00447X22，得到優(yōu)化酶解條件為：海帶經(jīng)切分勻漿后，在pH 6.0、添加纖維素酶11060 U·g-1、在室溫條件下酶解169 min，所得酶解液對ACE活性的抑制率可達到41.43%左右。試驗可知海帶酶解液對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）活性具有較高的抑制作用。

關(guān)鍵詞：酶解工藝;血管;緊張素轉(zhuǎn)化酶;海帶;纖維素酶

Abstract： In order to clarify the inhibiting effect of kelp on the activity of angiotensin converting enzyme， the effects of different additive amount of cellulase and enzymolysis time on the inhibition of angiotensin converting enzyme activity by kelp pulp were investigated by the single factor experiment and response surface optimization test. The results showed that the enzymatic hydrolysis of kelp pulp with cellulase was carried out， and the mathematical model of the inhibition rate Y of ACE activity in kelp enzymatic hydrolysate， the enzyme additive amount X1 and the enzymolysis time X2 was established： Y=-114.27304+0.00572X1+1.49199X2-3.33333×10-7X1X2-2.55200×10-7X12-0.00447X22. The optimal enzymolysis condition was obtained as follows： after the kelp was cut and homogenized， 11060 U·g-1 cellulase was added at pH 6.0 and the enzymatic hydrolysis was performed at room temperature for 169 min. The inhibition rate of the obtained enzymatic hydrolysate on ACE activity was about 41.43%. The results showed that the enzyme hydrolysate of kelp had a high inhibitory effect on the activity of angiotensin converting enzyme.

Key words： Enzymolysis technology; Blood vessel; Angiotensin converting enzyme; Kelp; Cellulase

海帶具有較高的營養(yǎng)價值和保健功效，是一種不可多得的藥食同源食品[1-2]。當(dāng)前，福建省海帶以干制粗加工產(chǎn)品為主，加工產(chǎn)品單一[3]。隨著人們生活水平的提高，人們對食品多樣化和功能化需求日益增加，具有一定保健功能的食品消費需求會逐漸加大。

海帶中含有豐富的營養(yǎng)成分，包括碘和鉀等微量元素、多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等，同時具有調(diào)節(jié)血脂、降血壓、降血糖、抗凝血及抗腫瘤等活性作用，非常適合開發(fā)深加工食品。已有研究對自發(fā)性高血壓大鼠喂飼海帶后血壓變化進行試驗觀察，結(jié)果表明海帶能有效降低大鼠動脈收縮壓，溫和有效地降低高血壓鼠的收縮壓和舒張壓，提示海帶可作為降血壓輔助藥物[4]。日本人通過食用海帶浸泡液以達到降血壓的目的[5]。本研究通過分析纖維素酶添加量和酶解時間對海帶漿抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）活性的影響，旨在開發(fā)提高海帶產(chǎn)品附加值，為海帶深加工提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

干海帶，市售;100 mmol·L-1、pH 8.3、含0.3 mmol·L-1 NaCl硼酸硼酸鈉緩沖液，自配;纖維素酶，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）、馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL），購自SigmaAldrich;馬尿酸標(biāo)準品（Hippuric acid），購自霍尼韋爾Fluka中國。

1.2 主要儀器

LC20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）;DAD20A型二極管陣列檢測器（日本島津公司）;DKS24型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）;TGL-16C型離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 海帶酶解液樣品前處理 干海帶充分復(fù)水后切成1 cm2左右的海帶片，加入10%的水，采用膠體磨進行破碎均質(zhì)，通過調(diào)節(jié)膠體磨的間隙得到均勻的海帶漿。加入5‰檸檬酸調(diào)節(jié)pH至6.0，加入定量纖維素酶，于25℃環(huán)境中，對海帶漿在不同酶解時間下進行酶解，得到酶解液樣品置于5℃冰箱備用。

1.3.2 纖維素酶添加量對海帶酶解液抑制ACE活性的影響 分別在樣品液內(nèi)添加0、5000、10000、15000 u·g-1纖維素酶，在25℃環(huán)境溫度下酶解120 min，測定ACE活性抑制率。

1.3.3 纖維素酶酶解時間對海帶酶解液抑制ACE活性的影響 以纖維素酶5000 u·g-1為添加量，在溫度25℃環(huán)境下分別對樣液進行120、150、180、210 min的酶解，測定ACE活性抑制率。

1.3.4 ACE活性抑制率測定 （1）色譜條件。色譜柱：symmetry C18 5 μm，4.6×150 mm。柱溫：25℃。檢測波長：228 nm。流速：0.5 mL·min-1。流動相：0.05%三氟乙酸TFA加0.05%三乙胺水溶液（pH 2.75～2.80）/乙腈=85∶15（v/v）。（2）操作方法。參考Cushman和Cheung等[6-8]的方法測定血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制活性。ACE 10 μL和樣品40 μL置于旋渦振蕩器中處理2 min，37℃保溫5 min，加入50 μL HHL混勻后，在37℃下反應(yīng)0.5 h，加入200 μL，1.0 mmol·L-1 HCl終止反應(yīng)，10000 r·min-1離心分離5 min，采用HPLC法在228 nm處測定反應(yīng)生成馬尿酸（HA， Hippuric acid）的吸收值。

ACE抑制活性根據(jù)以下公式計算：

抑制率（I%）=A-BB×100%

A：未添加抑制劑馬尿酸的峰面積在標(biāo)準曲線上對應(yīng)的濃度，單位mmol·L-1;

B：已添加抑制劑馬尿酸的峰面積在標(biāo)準曲線上對應(yīng)的濃度，單位mmol·L-1;

1.3.5 纖維素酶酶解條件的響應(yīng)面優(yōu)化分析 以酶添加量和酶解時間為因子，ACE活性抑制率為因變量設(shè)計響應(yīng)面分析試驗，通過試驗設(shè)計及Design Expert軟件分析，選取ACE活性抑制率最高的海帶酶解條件。依據(jù)Central Composite Design原理，試驗設(shè)計因素水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶添加量對海帶酶解液抑制ACE活性的影響

固定酶解時間為120 min，測定不同纖維素酶添加量條件下測定經(jīng)過研磨的海帶漿樣液對ACE活性抑制率的變化情況（圖1）。

由圖1可知，海帶酶解液對ACE活性抑制率隨著纖維素酶添加量的增大而提高，當(dāng)纖維素酶添加量小于5000 U·g-1時，酶解液對ACE活性的抑制能力變化明顯，抑制率從未添加纖維素酶空白組的2.7%提升至26.7%。此時纖維素酶破壞海帶細胞壁，將海帶細胞內(nèi)的活性成分釋放出來，表現(xiàn)出ACE活性抑制能力的提高[9];當(dāng)纖維素酶的添加量達到一定濃度時，海帶細胞壁被完全酶解，細胞內(nèi)ACE酶活性抵制成分釋放達到動態(tài)平衡，當(dāng)酶添加量超過10000 U·g-1時，酶解液添加量對ACE活性的抑制能力提高不明顯。

2.2 纖維素酶酶解時間對海帶酶解液抑制ACE活性的影響

固定酶添加量5000 U·g-1，在不同纖維素酶酶解時間下測定經(jīng)過研磨的海帶漿樣液對ACE活性抑制率的變化情況（圖2）。

由圖2可知，海帶酶解液對ACE活性抑制率隨著酶解時間的增加而逐漸增強。由于酶解時間的增加，海帶細胞壁的酶解率逐漸提高，海帶細胞內(nèi)ACE活性抑制成分釋放率也逐漸增大，因此海帶酶解液對ACE活性的抑制能力逐漸增強。當(dāng)酶解時間超過180 min后，細胞壁基本酶解完全，抑制率變化不明顯。對比圖1和圖2可知，適宜的纖維素酶添加量對海帶酶解液抑制ACE活性的能力影響更大，纖維素酶添加量的變化對ACE活性抑制率的影響相較于酶解時間更加明顯。

2.3 酶解條件對ACE活性抑制率影響的響應(yīng)面分析

響應(yīng)面法試驗結(jié)果及方差分析見表2、3。

由表3中可知，模型擬合度較高（P<0.05），因此該模型可較好的模擬酶解條件對海帶酶解液抑制ACE活性的影響規(guī)律。自變量一次項A、B和二次項A2、B2的P值均<0.01，表明它們對試驗結(jié)果均有極顯著的影響。失擬項P值為0.0861>0.05，表明該模型失擬因素不顯著，各因素值和響應(yīng)面之間的關(guān)系可用此模型函數(shù)化，可較好地預(yù)測試驗結(jié)果。

由方差分析結(jié)果得到二次響應(yīng)面回歸模型：

纖維素酶添加量和酶解時間對ACE活性抑制率交互作用的等高線和三維響應(yīng)面見圖3。

利用Design Expert軟件的Numerical Optimization功能，預(yù)測ACE活性抑制率最高時的條件為：纖維素酶添加量11060 U·g-1、酶解時間169 min;在此優(yōu)化條件下海帶酶解液對ACE活性的抑制率最高，為41.43%。

選取上述優(yōu)化條件進行海帶酶解液對ACE活性抑制率驗證試驗，酶解工藝參數(shù)為：纖維素酶添加量11060 U·g-1、酶解時間169 min，做3次平行試驗進行驗證，驗證結(jié)果表明在此酶解工藝條件下海帶酶解液對ACE活性的抑制率平均值為41.38%，該結(jié)果與理論預(yù)測值（41.43%）相差較小。表明響應(yīng)面法所得酶解條件對海帶漿酶解液ACE活性抑制率的方程模型具有較強的適用性、所得到的優(yōu)化條件準確可靠。

3 結(jié)論與討論

采用纖維素酶對海帶漿進行酶解，建立了海帶漿酶解液對ACE活性抑制率Y與酶添加量X1、酶解時間X2的數(shù)學(xué)模型：Y=-114.27304+0.00572X1+1.49199X2-3.33333×10-7X1X2-2.55200×10-7X12-0.00447X22。得到優(yōu)化酶解條件為：海帶經(jīng)切分勻漿后，在pH 6.0，纖維素酶添加11060 U·g-1，在室溫條件下酶解169 min，所得酶解液對ACE酶活性的抑制率可達到41.43%。由試驗數(shù)據(jù)及驗證試驗可知海帶酶解液對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）活性抑制率較高。

纖維素酶的作用機理為：水解開始首先由內(nèi)切葡聚糖酶作用于微纖維的非結(jié)晶區(qū)，由纖維二糖水解酶將不溶性纖維素水解生成可溶性的纖維糊精和部分纖維二糖，然后內(nèi)切葡聚糖酶再作用于部分降解的纖維素，水解成纖維二糖等低聚糖，最后由P葡萄糖昔酶將纖維二糖分解成葡萄糖[10]。食品加工中利用纖維素酶的特性，在許多產(chǎn)品的深加工過程中都有廣泛的應(yīng)用，如改善果蔬的可消化性、提高釀酒和醬油在加工過程中發(fā)酵的效率、作為速溶茶加工過程中的提取劑等。

已有研究表明[11]，降血壓肽具有抑制ACE活性的效果。由于海帶本身偏酸性，海帶在浸提過程中形成的水溶液呈弱酸性，使得海帶中蛋白能在酸性條件下進行水解，形成氨基酸和肽類[12]。因此，海帶酶解液對ACE活性的抑制作用可能與形成的降血壓肽有關(guān)。

本研究期望利用纖維素酶作用與海帶的植物細胞壁，將海帶中的降血壓肽等活性成分釋放出來，從而提升海帶中活性成分的溶出率。試驗證明該方法具有一定的可行性。同時通過磨漿和酶解的方法，在保留了海帶營養(yǎng)活性成分的前提下改變了其物理形態(tài)，可作為海帶深加工的基礎(chǔ)，進一步研發(fā)具有食療價值的海帶加工品，提升海帶自身的附加值，豐富海帶加工品的形態(tài)，擴大海帶產(chǎn)品的市場覆蓋率，對促進海帶及相關(guān)海產(chǎn)品加工市場具有積極的作用。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）