邱 天

(1. 長春師范大學 生命科學學院， 長春 130032； 2. 東北師范大學 植被生態(tài)科學教育部重點實驗室， 長春 130024；3. 東北師范大學 分子表觀遺傳學教育部重點實驗室， 長春 130024)

蘆葦(Phragmitesaustralis(Cav.) Trin. ex Steud.)是一種分布廣泛的濕地禾草，營養(yǎng)繁殖能力強，經(jīng)常出現(xiàn)在河湖岸邊的沼澤，也分布在旱地生境和其他承受著非生物脅迫的地區(qū)[1-2]。它豐富的表型變異、遺傳上高度的變異性以及靈活的繁殖對策使其成為世界性物種，在中國東北的松嫩平原上也廣泛分布。在堿化草甸上經(jīng)常作為伴生種生長，但在局域低洼地或堿斑上能形成單優(yōu)種群落[3]。由于高產(chǎn)和高蛋白含量，它是松嫩平原主要的飼草之一。蘆葦具有多年生根莖系統(tǒng)和對天然脅迫環(huán)境較強的適應性，因此能保留土壤養(yǎng)分，在生態(tài)修復方面具有重要的應用價值[4]。

在研究多年生物種的分子生態(tài)學問題時，常采用基因組掃描方法，應用擴增片段長度多態(tài) (Amplified fragment length polymorphisms, AFLPs)研究種群遺傳多樣性是眾多方法中最有效的方法之一[5-7]。這種分子標記已經(jīng)用于短芒野大麥(Hordeumbrevisubulatum)[8]、羊草(Leymuschinensis)[5]、虎杖(Fallopiajaponica)[9]、空心蓮子草(Alternantheraphiloxeroides)[10]、藏菠蘿花(Incarvilleayounghusbandii)[11]和堇菜屬植物(Violacazorlensis)[12]等物種的研究中。在最初AFLP技術基礎上加以改良，即應用毛細管電泳的熒光AFLP標記方法，由于其分辨率高、敏感性高以及所需樣本量少而成為一種有效、可靠的技術手段[13]。

在松嫩平原多種生境上生長的蘆葦表現(xiàn)出容易辨別的不同表型特征，包括葉片、根莖、苗的形態(tài)和生物量等方面[4,14]。我們關注于多種生境中的兩種。生境1(記為H1)是有季節(jié)性積水的低洼地，土壤為堿化草甸土，pH 8～8.5；生境2(記為H2)是沒有季節(jié)性積水的光堿斑，pH大于10。近50年來松嫩平原嚴重的土壤鹽堿化和植被退化導致草地上多種生境呈鑲嵌體形式存在，而H1和H2是其中的兩種。

關于松嫩平原蘆葦遺傳多樣性的初步調查表明，跨越一定地理范圍的蘆葦存在廣泛的遺傳變異[3]。除了序列變異，表觀遺傳機制能夠引起生態(tài)上相關的形態(tài)特征變異，其能被環(huán)境直接干擾而且遺傳給下一代，因此它是生物個體對環(huán)境響應的一種重要的機制。DNA甲基化變異是迄今研究最多的表觀遺傳機制，在植物中可遺傳。然而迄今為止，只有少量實驗應用MSAPs(Methylation-sensitive amplified polymorphisms，即甲基化敏感的AFLPs)研究天然植物種群的甲基化變異[6]，在小空間尺度上的研究更少[15-16]。鑒于此，作者在大致10 km×5 km范圍內(nèi)對兩種生境的蘆葦植株進行DNA水平的研究，分析了其表觀遺傳多樣性和結構。

1 材料與方法

1.1 研究生境的自然概況和材料取樣

材料來自于松嫩平原吉林省長嶺縣東北師范大學草地科學研究站內(nèi)(123°45′E, 44°45′N)。該區(qū)域屬于溫帶半干旱、半濕潤季風氣候。兩種蘆葦分布在土壤含水量和pH值不同的生境里。在H1中，土壤是堿化草甸土，pH 8～8.5，在雨季有季節(jié)性積水。單優(yōu)種蘆葦群落由于有充分的水分供應而高大茂盛，群落蓋度85%以上。在H2中，堿斑土壤板結，表層土完全喪失，pH值大于10。植株矮小，零星地呈叢分布，形成單優(yōu)種群落，群落蓋度小于20%。每種生境的蘆葦由于多種生境呈鑲嵌體形式存在而分布廣泛。在大致10 km×5 km研究范圍內(nèi)，隨機采集每種生境20個個體，它們位于研究站的西部、中部和東部，即每種生境3個種群。所有個體至少間隔30 m，以避免采集同一基株。H1和H2每個采樣地點的個體數(shù)分別是6、7、7和7、6、7，最小化蘆葦采集量對局域土壤的影響是一個考慮因素。葉片用充足的硅膠干燥后儲存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 MSAP表觀遺傳印記

應用改良的CTAB法提取基因組DNA[17-19]。在標準的AFLP基礎上，有少量技術改進[17-19]，包括應用熒光標記選擇性引物和96道毛細管的ABI-automated 3730XL基因分析儀。通過篩選得到能提供最可靠譜帶的引物，引物序列參見文獻[20]。MSAP和AFLP的操作一致，只是MspⅠ或HpaⅡ取代了MseⅠ，MspⅠ和HpaⅡ能夠識別相同的5′-CCGG位點但對甲基化的敏感性不同。ROX500 Marker (Applied Biosystems) 用于每一個樣本。應用軟件GeneMapper v.4.1收集、記錄原始數(shù)據(jù)。通過兩次獨立的AFLP分析，只記錄重復性好的譜帶，并用二進制數(shù)記錄，即“0”代表無帶而“1”代表有帶。所有樣本只有一條不一致譜帶的情況不記。只記錄大于等于100 bp的譜帶。MSAP譜帶有3種不同的類型：1)EcoR I/HpaII和EcoR I/MspI酶切擴增產(chǎn)物中均有帶；2)EcoR I/HpaII和EcoR I/MspI酶切擴增產(chǎn)物中均無帶；3)僅EcoR I/HpaII 或EcoR I/MspI酶切擴增產(chǎn)物中有帶。類型(1)代表非甲基化狀態(tài)，類型(3)代表甲基化狀態(tài)，類型(2)代表序列突變或甲基化增加，記為缺省值。根據(jù)MspI和HpaII不一致情況的比率是否超過誤差引起不一致的比率，將每個位點分為“甲基化敏感的位點”(Methylation susceptible loci, MSL)或“甲基化不敏感的位點”(Non-methylated loci, NML)[21]。在樣本情況未知的情況下進行記帶和統(tǒng)計。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應用R軟件中的msap軟件包分析MSAP結果[22]。應用Popgene 1.32軟件得到生境的多態(tài)位點百分比(P)和香濃維納信息指數(shù)(I)數(shù)據(jù)[23]。應用GENALEX 6.5(999 random permutations)進行分子方差分析(AMOVA)，將方差分解為生境間、種群間以及種群內(nèi)成分用以評價表觀遺傳結構[24]。

2 結果與分析

2.1 表觀遺傳多樣性

在938個MSAP位點中，633個是甲基化敏感位點(MSL)，其中71.09%～88.38%是多態(tài)位點；305個位點是甲基化不敏感位點(NML)，81.82%～88.12%是多態(tài)位點。記帶誤差率較低，在2.9%以下(表1)。在生境內(nèi)水平，H1和H2中分別有12.33%、11.31%的甲基化敏感位點(MSL)是外側胞嘧啶半甲基化的，14.14%、14.69%的位點是內(nèi)側胞嘧啶甲基化的，18.6%、19.38%是未甲基化的，以及其余的54.93%、54.63%是全甲基化或由于序列突變而缺乏限制性酶切位點的。由此可見兩種生境內(nèi)側胞嘧啶甲基化的比率均高于外側胞嘧啶半甲基化的比率。H1外側胞嘧啶半甲基化的水平比H2的高約1%，H2的內(nèi)側胞嘧啶甲基化水平比H1的高約0.5%，可以確定總甲基化水平H1比H2略高。而H2的未甲基化情況的比率高于H1的。所有位點中，H1和H2分別有82.75%和79.93%位點是多態(tài)的，香濃維納信息指數(shù)(I)分別是0.3712和0.358，可見H1高于H2(表2)。

表1 MSAP各引物組合下擴增位點的表觀遺傳多樣性信息

注：①記帶誤差率=(100×兩次獨立分析中不一致的標記數(shù))/(標記數(shù)×個體數(shù))。②不一致的EcoR I-HpaII 和EcoR I-MspI標記的平均可能性=eHpa+eMsp-2×eHpa×eMsp，其中eHpa和eMsp為記帶誤差率

Note: 1)The scoring error rates were calculated as 100×(number of inconsistent scores in two independent analyses)/(number of markers×number of individuals).2) Estimated average probability of receiving inconsistentEcoR I-HpaII andEcoR I-MspI scores was calculated as eHpa+eMsp-2eHpaeMspfrom the scoring error rates eHpaand eMsp

表2 2種生境蘆葦?shù)谋碛^遺傳多樣性參數(shù)和甲基化水平

2.2 表觀遺傳結構

Hierarchical AMOVA表明生境間表觀遺傳分化達到極顯著水平(P<0.01)，它解釋了1.75%的總體分子方差，2.67%歸因于生境內(nèi)種群間的極顯著分化(P<0.01)，95.57%歸因于種群內(nèi)極顯著分化(P<0.001)。種群表觀遺傳分化的量度PhiPT，與FST類似，值為0.044(表3)。

3 討論與結論

迄今為止，有關評價野生植物種群的表觀遺傳變異的范圍和結構的報道還很少。DNA甲基化變異可以遺傳，影響植物表型甚至進化。本文研究分析了蘆葦在兩種生境DNA甲基化，結果發(fā)現(xiàn)植株存在廣泛的DNA甲基化，約2/3的MSAP位點是甲基化敏感位點(MSL)，約1/3的位點是甲基化不敏感位點(NML)。MSL中多態(tài)位點所占的百分比較高，這與紫羅蘭Violacazorlensis的研究報道相一致[21]。高水平的表觀遺傳基因型變異可能會帶來更多的表型和進化靈活性，甚至影響物種的分布。在美國緬因州，入侵種蘆葦比本地種的表觀遺傳變異更多就例證了這一點[16]。本文發(fā)現(xiàn)了廣泛的生境內(nèi)方差，這是由個體變異所致，單獨個體的表觀遺傳變異是植物發(fā)生微進化的先決條件[21]。

表3 基于MSAP譜帶的蘆葦不同生境間和生境內(nèi)的AMOVA結果(生境內(nèi)按地理位置分3個種群)

本文還發(fā)現(xiàn)了兩種生境之間明顯的表觀遺傳分化。由于表觀遺傳修飾能在變化的環(huán)境中改變基因表達，進而改變表型，而又不依賴遺傳變異，這可能解釋了不同生境蘆葦表型不同的原因。此外，分子方差結果表明,天然蘆葦?shù)谋碛^遺傳變異能夠分成生境間和生境內(nèi)不同的組分。

H1的表觀遺傳多樣性參數(shù)的值均高于H2的值，這與生境幅度變異假說一致[25]。即如果種群所在的生境范圍更廣闊、更加多樣，如H1，會比生境范圍狹窄的種群如H2的變異更多。

關于特定表觀遺傳位點類型是僅僅作為遺傳變異的下游產(chǎn)物，還是獨立于遺傳變異，仍然是一個亟待解決的問題。本文中表觀遺傳變異的類型可能是遺傳變異導致的，也可能與生物體應對異質生境發(fā)生分化有關。盡管基因組重組和遺傳突變推動著生物體長期的進化，而表觀遺傳修飾也能使局域環(huán)境中的生物更快、更靈敏地適應變化的環(huán)境[26]。

總之，本研究結果有助于人們對小空間尺度上局域生境蘆葦?shù)谋碛^遺傳基礎的深入理解。蘆葦基因組MSAP標記的數(shù)據(jù)將為生態(tài)適應性理論研究和包括生態(tài)修復、遺傳改良在內(nèi)的保護和應用研究，提供有價值的參考。