NANANG Zulkarnaen，程 誼,2,3，張金波,3,4*

(1 南京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院，南京 210023；2 江蘇省地理環(huán)境演化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育建設(shè)點(diǎn)，南京 210023；3 江蘇省地理信息資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210023；4 南京師范大學(xué)虛擬地理環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023)

土壤反硝化作用通常是指微生物在厭氧或微量氧氣環(huán)境下的NO呼吸過程，該過程中反硝化微生物將NO、NO、NO 或N2O 作為電子受體，并將其還原為NO、NO、N2O 或N2。反硝化過程是氮素循環(huán)的重要環(huán)節(jié)，是活性氮轉(zhuǎn)化為惰性氮(N2)離開土壤、水體等系統(tǒng)回到大氣的最主要的過程[1]。從生態(tài)學(xué)角度考慮，反硝化作用是平衡生態(tài)系統(tǒng)活性氮輸入的重要機(jī)制。從環(huán)境保護(hù)的角度講，反硝化過程對于移除水體中NO–3，保護(hù)水體環(huán)境具有重要的作用[1]。然而，在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，反硝化過程是肥料氮損失的重要途徑，據(jù)估算，全球氮肥反硝化損失約占氮肥總用量的12% ～ 30%[2]。但是，由于反硝化速率及其產(chǎn)物比例的時空變異非常大，導(dǎo)致不同學(xué)者估算的全球氮素反硝化損失量有巨大的差異(83 ～ 390 Tg/a)[3]。另外，反硝化過程的中間產(chǎn)物N2O 是一種重要的溫室氣體，N2O 還參與大氣中許多光化學(xué)反應(yīng)，破壞大氣O3層。土壤硝化-反硝化過程釋放的N2O 是全球N2O 的重要來源。因此，反硝化作用和氣態(tài)產(chǎn)物比例及其影響因素一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。

凡是能影響到土壤反硝化微生物生存和活性的因素均會影響土壤反硝化作用及其氣態(tài)產(chǎn)物比例。其中，作為土壤微生物的主要能源和電子供體，土壤有機(jī)質(zhì)是影響反硝化作用的重要因素，一般認(rèn)為，土壤有機(jī)質(zhì)越高，反硝化勢越大[4]；而且有機(jī)碳的形態(tài)也會影響土壤反硝化勢，研究表明與總有機(jī)碳含量相比，易礦化碳與反硝化勢的關(guān)系更為密切，土壤反硝化作用明顯地受到嫌氣易礦化態(tài)碳量的限制[5]。一些學(xué)者認(rèn)為，土壤有機(jī)碳的空間差異是導(dǎo)致反硝化作用巨大的空間變異性的重要因素之一[6]。土壤有機(jī)碳可以促進(jìn)反硝化中間產(chǎn)物 N2O 產(chǎn)生，也可以促進(jìn) N2O還原。通常 N2O 排放量隨土壤有機(jī)碳含量增加而增加，而N2/N2O 也隨之增加[7]。作為反硝化的底物，NO也是影響土壤反硝化作用的因素，通常反硝化速率隨 NO含量的增加而增加，但是當(dāng) NO含量增加到較高的水平后，反硝化速率會趨于穩(wěn)定。有研究報(bào)道當(dāng)土壤 NO含量達(dá)到 25 ～ 100 mg/kg 時，反硝化勢與土壤 NO含量無關(guān)[8]。高濃度 NO或 NO會抑制 N2O 還原為 N2，N2/N2O 降低[7]。土壤 pH 會影響微生物活性，同時還會影響碳的有效性，進(jìn)而影響反硝化作用，在一定范圍內(nèi)，反硝化速率隨 pH 的升高而升高[9-10]。通常認(rèn)為 N2O 還原酶對酸性條件比較敏感，因此酸性土壤有利于 N2O 產(chǎn)生[7]，N2/N2O 隨 pH 升高而升高[11]。土地利用方式會顯著影響土壤有機(jī)碳含量及組成、土壤 pH、微生物性質(zhì)等土壤性質(zhì)，進(jìn)而可能影響反硝化作用[12]。土地利用方式的變化會直接影響有機(jī)物質(zhì)的輸入輸出平衡，引起土壤有機(jī)碳含量的顯著變化[13]。不同的種植制度、管理方式對土壤 pH 有明顯的影響。例如種植茶樹、竹子通常會降低土壤 pH，而種植水稻會提高土壤 pH；另外，施用石灰也會明顯提高土壤 pH。這些理化性質(zhì)的變化可能會進(jìn)一步影響反硝化功能微生物[1,12]。反硝化速率的測定方法主要有乙炔抑制法和15N 標(biāo)記方法；根據(jù)測定的是氣態(tài)產(chǎn)物還是反硝化底物不同，又可分為氣體產(chǎn)物產(chǎn)生速率測定法和底物消失速率測定法[1,3,12,14]。乙炔抑制法具有成本低、操作相對簡單便捷等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于反硝化速率及其氣態(tài)產(chǎn)物的時空變化及其影響因素研究[3]。目前為止，對陸地系統(tǒng)反硝化速率及其氣態(tài)產(chǎn)物組成的評估主要是基于乙炔抑制法提供的大量數(shù)據(jù)。

紅壤區(qū)是中國重要的糧食、經(jīng)濟(jì)作物生產(chǎn)區(qū)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上占有重要地位。高強(qiáng)度的土地利用和農(nóng)業(yè)管理措施強(qiáng)烈地影響土壤理化性質(zhì)，影響土壤微生物數(shù)量和活性，進(jìn)而會影響土壤氮素循環(huán)過程，其中也包括土壤反硝化過程，從而對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生態(tài)環(huán)境等帶來一系列的影響。研究不同利用方式紅壤反硝化勢和氣態(tài)產(chǎn)物排放特征，闡明其影響因素，對于制定合理的利用規(guī)劃和農(nóng)業(yè)管理措施，減少氮素的負(fù)面環(huán)境影響具有重要的意義。為此，本研究在江西鷹潭選取林地、竹林、茶園、旱地農(nóng)田 4 種利用方式的紅壤作為研究對象，采用實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)試驗(yàn)方法，對不同土地利用方式下的紅壤反硝化作用進(jìn)行研究，以期明確：①土地利用方式對紅壤反硝化勢的影響及其作用機(jī)理；②反硝化氣態(tài)產(chǎn)物 N2O 和 N2的排放及其影響因素。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

供試土樣采自我國典型的紅壤區(qū)江西省鷹潭市。研究區(qū)年平均降雨量為1 785 mm (30 a 均值)，年平均溫度為18.4 °C(30 a 均值)。自然植被以馬尾松(Pinus massoniana Lamb)、櫟木(Quercus Mongolia)和杉木(Cunninghamia lanceolata(Lamb.)Hook.)為主。目前主要利用方式為林地、茶園、竹林、旱地和稻田等?；蚀罅渴┯糜诘咎?、旱地和茶園上，旱地有施用石灰改良酸性土壤的傳統(tǒng)[3]。選取林地、茶園、竹林和旱地4 種利用方式，每種利用方式選取不同的3個地點(diǎn)作為3 次重復(fù)，共計(jì)12 個采樣地點(diǎn)。于2017年10 月，在每一個地點(diǎn)隨機(jī)選取5 個點(diǎn)，采集0 ～20 cm 土層土樣，然后充分混合作為一個樣品。所有樣品過2 mm 篩，分成3 份，1 份風(fēng)干，用于測定土壤理化性質(zhì)，1 份放于 -80 °C 冰箱中保存，用于提取DNA 測定土壤微生物性質(zhì)，1 份放于4 °C 冰箱中保存，用于測定反硝化勢和氣態(tài)產(chǎn)物排放速率。

1.2 厭氧培養(yǎng)試驗(yàn)

本研究采用厭氧(淹水、培養(yǎng)瓶頂空充氮?dú)?、土壤中加入KNO3、25 °C 恒溫條件培養(yǎng)方法，測定反硝化勢和氣態(tài)產(chǎn)物N2O 和N2排放速率。每個土壤樣品稱取10 份保鮮土樣，每份20 g(干土重)，分別裝入250 ml 三角瓶中，用帶氣體采樣口的硅橡膠塞密封。設(shè)置加乙炔和不加乙炔2 個處理，不加乙炔處理用于測定N2O 的排放速率，加乙炔和不加乙炔處理的差值用于計(jì)算N2的排放速率，每個處理5 次重復(fù)。具體培養(yǎng)方法：在培養(yǎng)開始前，加乙炔處理的培養(yǎng)瓶內(nèi)先加入10% 的乙炔，好氧狀態(tài)下預(yù)培養(yǎng)24 h，以確保乙炔在土壤孔隙結(jié)構(gòu)中充分?jǐn)U散，充分發(fā)揮抑制效果，不加乙炔處理同樣預(yù)培養(yǎng)24 h。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，所有處理按水︰土為1︰1 加入蒸餾水，然后加入50 mg/kg 的KNO3，馬上塞緊硅橡膠塞，連接到抽真空裝置上，進(jìn)行抽真空-充入高純氮?dú)獠僮?，重?fù)3 次，每次10 min。之后，馬上用20 ml 注射器從加乙炔處理培養(yǎng)瓶中取出一定量的氣體，馬上加入相同體積的乙炔，使培養(yǎng)瓶內(nèi)乙炔的濃度達(dá)到10%。隨后將所有培養(yǎng)瓶置于搖床上震蕩15 min (25℃，250 r/min)，再置于25 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h后，采集氣體樣品，測定N2O 和CO2濃度。采樣前先用20 ml 注射器反復(fù)抽提培養(yǎng)瓶中氣體，使其充分混合，然后采集三角瓶上部空間氣體20 ml，用氣相色譜儀(Agilent 7890)測定N2O 和CO2濃度。分別在培養(yǎng)開始的6、24、48、72 h 采集氣體樣品，每次采樣前均進(jìn)行如上所述的抽真空-充氮?dú)?加乙炔-振蕩操作，并培養(yǎng)6 h。

1.3 樣品分析方法

土壤 pH 用 DMP-2 mV/pH 計(jì) (Quark Ltd,Nanjing, China)測定，土：水為1：5(m/V)；土壤有機(jī)碳的測定用重鉻酸鉀容量法；土壤全氮的測定用半微量開氏法。

土壤DNA 的提取及反硝化功能基因豐度的檢測參照Yu 等[12]的方法：稱取0.5 g 置于 -80 ℃ 冰箱中保存的供試土壤，用FastDNA SPIN DNA 提取試劑盒(MP Biomedicals)， 按說明書上的步驟進(jìn)行土壤總DNA的提取。用于定量反硝化功能基因nirK，nirS，nosZ的引物，如表1 所示。定量PCR 的擴(kuò)增條件為95 ℃ 預(yù)變性2 min，95 ℃ 變性10 s，58 ℃ 退火20 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)40 次。每個樣品設(shè)置3個測量重復(fù)，陰性對照以ddH2O 代替模板DNA。擴(kuò)增產(chǎn)生的溶解曲線和瓊脂糖凝膠電泳分析用于檢測擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)方法

反硝化過程中，N2O 和N2產(chǎn)生速率采用以下公式計(jì)算：

式中：VN2O為N2O 產(chǎn)生速率(μg/(kg·h))；V乙炔處理N2O和V無乙炔處理N2O分別為加乙炔處理和未加乙炔處理的N2O 產(chǎn)生速率(μg/(kg·h))；ρ1為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下N2O-N 的濃度(1.25 g/L)；C1為N2O 氣體濃度(10–9L/L)；Vg是培養(yǎng)瓶上部有效空間體積(ml)；Vl為液體體積(ml)；α為Bunsen 校正系數(shù)，25 °C 時為0.549；W為烘干土重(kg)；T為測定氣體時的溫度，25 °C。累積產(chǎn)生量為相鄰2 次測定的氣體產(chǎn)生速率的平均值與測定時間間隔乘積的累加值。

表1 定量PCR 的引物序列Table 1 Primers used for real-time PCR

在反硝化研究中，土壤反硝化勢通常有兩種表征方法：①用培養(yǎng)過程中NO–3-N 減少量表征；②用培養(yǎng)過程中氣態(tài)產(chǎn)物的產(chǎn)生量表征。許多研究表明，NO–3-N 加入土壤后，在極短的時間(幾小時，甚至是幾十分鐘)內(nèi)會大量地被土壤固定[14]，這部分NO–3-N減少量并沒有發(fā)生反硝化，使用NO–3-N 減少量表征土壤反硝化勢存在過高估算反硝化勢的問題，因此，本研究采用氣態(tài)產(chǎn)物的產(chǎn)生總量表征土壤反硝化勢。文中用反硝化勢來表示土壤反硝化作用強(qiáng)度，是文獻(xiàn)中對在淹水、厭氧、密閉條件下土壤中加入NO–3-N 而不加有機(jī)碳所得到的反硝化強(qiáng)度的專指[15]。本文中反硝化勢(N，μg/(kg·h)) 為N2O 和N2產(chǎn)生速率之和。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件中的Pearson’s rank 方法和逐步回歸方法分析反硝化勢、N2O 和N2排放速率、N2/N2O 與土壤性質(zhì)的關(guān)系。采用方差分析比較不同利用方式土壤間反硝化勢N2O 和N2排放速率、N2/N2O，以及主要土壤性質(zhì)的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 土壤性質(zhì)

供試土壤均為酸性，竹林土壤pH 最低(4.49)，旱地農(nóng)田土壤最高(4.84)(表2)。土壤有機(jī)碳含量為9.46 ～30.47 g/kg，其中茶園土壤有機(jī)碳含量最高 (30.47 g/kg)，旱地土壤最低 (9.46 g/kg)。土壤全氮含量 0.83～2.25 g/kg，也是茶園最高，旱地最低。林地土壤C/N最高 (21.51)，旱地土壤最低 (11.48)。厭氧培養(yǎng)期間，林地、茶園、旱地和竹林土壤CO2累積排放量分別為C 297.4、389.2、235.1 和561.1 mg/kg，其中茶園土壤顯著高于其他3 種利用方式土壤，旱地土壤CO2累積排放量最低。

表2 供試土壤理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of soils under different land use types

2.2 nirS、nirK 和nosZ 基因豐度

林地、茶園、旱地和竹林土壤nirS基因豐度分別為5.50×106、5.86×106、5.57×106和5.85×106copies/g，不同利用方式間沒有顯著的差異(圖1)。林地、茶園、旱地和竹林土壤nirK基因豐度分別為6.51× 106、6.79×106、6.46×106和7.05×106copies/g，其中竹林土壤nirK基因豐度顯著高于其他3 種利用方式，其次是茶園土壤，林地和旱地最低。旱地土壤nosZ基因豐度最低(6.57×106copies/g)，顯著低于其他3 種利用方式土壤(圖1)。nirS基因豐度與CO2累積排放量呈正相關(guān)關(guān)系(P=0.05)；nirK基因豐度與土壤總有機(jī)碳(P＜0.05)和CO2累積排放量(P＜0.01)呈顯著的正相關(guān)關(guān)系；nosZ基因豐度也與土壤總有機(jī)碳(P＜0.05)和CO2累積排放量(P＜0.05)呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。逐步回歸分析結(jié)果表明，土壤CO2累積排放量和有機(jī)碳含量分別可以解釋不同利用方式土壤nirK基因豐度變化的 75% (P＜0.001)和nosZ基因豐度變化的55%(P＜0.01)。

2.3 N2O 和N2 排放速率

不同利用方式土壤N2O 和N2排放速率差異明顯(圖2)。在培養(yǎng)期間，林地、茶園、竹林土壤的N2O排放速率均逐漸升高，在72 h 達(dá)到峰值，而旱地土壤N2O 排放速率變化不大。整個培養(yǎng)期間，林地、茶園、旱地和竹林土壤N2O 平均排放速率分別為N 25.89、43.20、1.38 和51.75 μg/(kg·h) (圖2)。旱地土壤N2O 平均排放速率顯著低于竹林和茶園土壤，與林地差異不顯著；竹林土壤N2O 平均排放速率最高，但是與林地和茶園差異不顯著。N2O 平均排放速率與土壤有機(jī)碳(P＜0.05)和厭氧培養(yǎng)期間土壤CO2累積排放量(P＜0.01)呈顯著的正相關(guān)關(guān)系；N2O 平均排放速率隨土壤pH 的升高呈顯著的指數(shù)遞減趨勢(P＜0.01)(圖3)。N2O 平均排放速率與測定的反硝化功能基因豐度沒有顯著的相關(guān)性。逐步回歸分析結(jié)果表明，土壤CO2累積排放量是造成不同利用方式紅壤N2O 平均排放速率差異的主要原因，可以解釋N2O 平均排放速率變化的58% (P＜0.01)。

圖1 不同利用方式土壤nirS、nirK 和nosZ 基因豐度Fig. 1 Abundances of nirS, nirK and nosZ genes in soils under different land use types

圖2 不同利用方式土壤N2O(A)、N2(B)排放速率，反硝化勢(C)和N2/N2O(D)Fig. 2 Emission rates of N2O (A) and N2 (B), denitrification potential (C) and N2/N2O (D) ratios in soils under different land use types

圖3 N2O 平均排放速率與土壤有機(jī)碳、厭氧培養(yǎng)期間土壤CO2 累積排放量、土壤pH 的關(guān)系Fig. 3 Relationships between average N2O emission rate and SOC, soil CO2 cumulative emission during anaerobic culture, soil pH

不同利用方式土壤N2排放速率隨著培養(yǎng)時間明顯增加，特別是在30 h 后，竹林和茶園土壤N2排放速率急劇增加。整個培養(yǎng)期間，林地、茶園、旱地和竹林土壤N2平均排放速率分別為N 70.81、209.05、32.17 和222.18 μg/(kg·h) (圖2)。與N2O 平均排放速率相似，旱地土壤N2平均排放速率顯著低于竹林和茶園土壤，與林地差異不顯著；竹林土壤N2平均排放速率最高，但是與林地和茶園差異不顯著。N2平均排放速率與土壤有機(jī)碳(P＜0.05)和厭氧培養(yǎng)期間土壤CO2累積排放量(P＜0.01)呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(圖4)。N2平均排放速率與測定的反硝化功能基因豐度沒有顯著的相關(guān)性。逐步回歸分析結(jié)果表明，土壤CO2累積排放量是造成不同利用方式紅壤N2排放速率差異的主要原因，可以解釋N2排放速率變化的59% (P＜0.01)。

不同利用方式土壤反硝化氣態(tài)產(chǎn)物N2/N2O 平均值為2.8 ～ 68.4(圖2D)。其中，旱地土壤N2/N2O 比值最大(68.4)，其次是茶園(8.3)，再次是竹林(4.9)，林地最小(2.8)。但是，由于空間變異極大，不同利用方式間N2/N2O 比值差異不顯著。N2/N2O 與土壤pH 呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)。但是N2/N2O 與土壤有機(jī)碳，以及測定的反硝化功能基因豐度沒有明顯的相關(guān)性。

圖4 N2 平均排放速率與土壤有機(jī)碳和厭氧培養(yǎng)期間土壤CO2 累積排放量的關(guān)系Fig. 4 Relationship between average N2 emission rate and SOC, soil CO2 cumulative emission during anaerobic culture

2.4 反硝化勢

本研究采用氣態(tài)產(chǎn)物的產(chǎn)生量，即N2O 和N2排放速率的和，表征土壤反硝化勢。培養(yǎng)期間，林地、茶園、旱地和竹林土壤反硝化勢分別為N 96.70、252.25、33.54 和273.11 μg/(kg·h) (圖2C)。旱地土壤反硝化勢顯著低于竹林和茶園土壤，與林地差異不顯著；竹林土壤反硝化勢最大，顯著高于林地，但與茶園差異不顯著。反硝化勢與土壤有機(jī)碳(P＜0.05)、厭氧培養(yǎng)期間土壤CO2累積排放量(P＜0.01)、nirS基因豐度(P＜0.05)和nirK基因豐度(P＜0.05)呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(圖5)。逐步回歸分析結(jié)果表明，土壤CO2累積排放量是造成不同利用方式紅壤反硝化勢差異的主要原因，可以解釋反硝化勢變化的 66%(P＜0.01)。

圖 5 反硝化勢與土壤有機(jī)碳、厭氧培養(yǎng)期間土壤CO2 累積排放量、nirS 和nirK 基因豐度的關(guān)系Fig. 5 Relationships between denitrification potential and SOC, soil CO2 cumulative emission during anaerobic culture, nirS and nirK gene abundances

3 討論

本研究結(jié)果表明，在嚴(yán)格厭氧(淹水、培養(yǎng)瓶頂空充氮?dú)?和添加NO底物的條件下，所有供試紅壤N2排放速率均高于N2O，特別是在pH 較高的旱地紅壤N2/N2O 高達(dá)68.4。不同利用方式紅壤反硝化勢、N2O 和N2排放速率存在明顯的差異，其中旱地紅壤反硝化勢、N2O 和N2排放速率均最低，表明土壤pH的提升并沒有增加旱地紅壤的反硝化損失風(fēng)險(xiǎn)和N2O 排放速率。土壤有機(jī)碳，特別是易礦化有機(jī)碳含量，是影響紅壤反硝化作用和N2O 和N2排放速率的主要因素，土壤pH 對氣態(tài)產(chǎn)物中N2/N2O 有明顯的影響。

3.1 土壤有機(jī)碳是控制不同利用方式紅壤反硝化勢、N2O 和N2 排放速率的主要因素

反硝化作用是需要獲得電子的異養(yǎng)呼吸過程[16]。土壤有機(jī)碳礦化過程是主要的提供電子的過程，而且還能為反硝化微生物提供碳源和能源，所以土壤有機(jī)碳是影響反硝化作用的重要因素，有機(jī)碳的礦化過程是反硝化的主要驅(qū)動因子[17]。本研究中，厭氧培養(yǎng)期間CO2累積排放量與反硝化勢存在顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)，其相關(guān)系數(shù)(r=0.81)高于總有機(jī)碳含量與反硝化勢的相關(guān)系數(shù)(r=0.73)。這一結(jié)果說明，與總有機(jī)碳含量相比，易礦化碳與反硝化勢的關(guān)系更為密切，土壤嫌氣易礦化態(tài)碳量是控制紅壤反硝化勢的重要限制因子，土壤有機(jī)碳礦化量大，為反硝化作用提供更多的電子，并為反硝化微生物提供更多的能量和碳源。本研究中，反硝化功能基因nirS、nirK、nosZ的豐度均與培養(yǎng)期間CO2累積排放量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步支持了我們的結(jié)論。前人研究結(jié)果也表明，以CO2排放量表征的易礦化碳與以氣態(tài)產(chǎn)物產(chǎn)生量表征的反硝化勢呈顯著的正相關(guān)[18-20]。本研究中，旱地紅壤易礦化有機(jī)碳含量最低，所以其反硝化勢也最低；竹林和茶園易礦化有機(jī)碳含量較高，其反硝化勢也較高。土壤有機(jī)碳也可以促進(jìn)反硝化中間產(chǎn)物N2O 產(chǎn)生，本研究結(jié)果表明，N2O 排放速率隨CO2累積排放量增加而增加(P＜0.01)，其可以解釋不同利用方式紅壤N2O 排放速率變化的58% (P＜0.01)；同時N2平均排放速率也與土壤CO2累積排放量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)，可以解釋不同利用方式紅壤N2排放速率變化的59% (P＜0.01)。土壤CO2累積排放量表征的易礦化碳是造成不同利用方式紅壤N2O和 N2排放速率差異的主要原因。但是沒有發(fā)現(xiàn)N2/N2O 與土壤有機(jī)碳之間存在顯著的相關(guān)性。

3.2 土壤pH 影響不同利用方式紅壤反硝化氣態(tài)產(chǎn)物N2/N2O

本研究結(jié)果表明，N2/N2O 與土壤pH 呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)，而且N2O 排放速率隨土壤pH的升高呈顯著的指數(shù)遞減趨勢(P＜0.01)(圖3)。通常認(rèn)為，N2O 還原酶對酸性條件比較敏感，因此酸性土壤有利于N2O 產(chǎn)生，N2/N2O 隨pH 升高而升高[7,11,21-22]。雖然旱地紅壤反硝化勢和氣態(tài)產(chǎn)物N2O 和N2排放速率都是不同利用方式土壤中最低的，但是由于農(nóng)田管理方式，如施石灰等，導(dǎo)致旱地紅壤pH 較高，使得旱地氣態(tài)產(chǎn)物N2/N2O 最大。Koskinen 和Keeney[9]報(bào)道在土壤pH 接近中性條件下(pH 6.9)，N2是主要產(chǎn)物，而酸性土壤條件(pH 4.6)則有利于N2O 的排放。因此，土壤pH 可作為反硝化作用氣態(tài)產(chǎn)物中N2/N2O的預(yù)測參數(shù)[23]。土壤pH 是影響土壤微生物群落組成的重要因素[24]，其影響N2/N2O 的原因主要是酸性條件抑制N2O 還原酶活性，從而導(dǎo)致N2O 排放增加[21,25]。有研究報(bào)道nirK、nirS和nosZ功能基因豐度與pH 存在顯著的正相關(guān)關(guān)系[22]。然而，在本研究結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)nirK、nirS和nosZ功能基因豐度與pH 的關(guān)系；而逐步回歸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，土壤CO2累積排放量和有機(jī)碳含量分別是控制nirK和nosZ基因豐度的關(guān)鍵因素。也有研究認(rèn)為N2O 還原為N2的量可能與nosZ基因的數(shù)量無關(guān)，而是與nosZ基因的活性有關(guān)[26]。所以，土壤pH 影響紅壤反硝化氣態(tài)產(chǎn)物N2/N2O 的微生物機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

需要指出的是，本研究使用的乙炔抑制法也存在一些缺陷，會影響反硝化勢和氣態(tài)產(chǎn)物的測定結(jié)果，主要表現(xiàn)在培養(yǎng)過程中乙炔會發(fā)生降解或作為一種碳源被微生物利用，進(jìn)而導(dǎo)致其濃度下降，降低抑制效果；另外，乙炔在土壤空隙中擴(kuò)散速率較低，擴(kuò)散不完全，從而影響抑制效果，進(jìn)而低估土壤反硝化勢[27-28]。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，土地利用方式對紅壤反硝化勢、N2O 和N2排放速率有明顯的影響。旱地紅壤反硝化勢、N2O 和N2排放速率均最低，茶園和竹林較高。土壤有機(jī)碳，特別是CO2累積排放量表征的易礦化碳是造成不同利用方式紅壤反硝化勢、N2O 和N2排放速率差異的主要原因。反硝化功能基因nirS、nirK、nosZ 的豐度均與CO2累積排放量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步支持了以上結(jié)論。旱地紅壤N2/N2O最大，其次是茶園，再次是竹林，林地最小，土壤pH 是影響N2/N2O 的主要因素。但是土壤pH 影響紅壤反硝化氣態(tài)產(chǎn)物N2/N2O 的微生物機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。