周 丹 鄭建仙 - 鄧雯婷 -

(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640)

鱈魚是常見的可食用海水魚類之一，其魚肉雪白，肉質(zhì)嫩滑且營養(yǎng)豐富[1]。研究[2-3]表明，疑似食物過敏兒童患者鱈魚IgG抗體檢測陽性率僅次于牛奶和雞蛋，食物過敏患者鱈魚IgG抗體檢測陽性率僅次于蟹、蝦和雞蛋。魚類過敏會引發(fā)不同程度的反應(yīng)，如口腔過敏、腹痛、腹瀉、嘔吐、過敏性休克等癥狀[4]。鱈魚的主要過敏原為小清蛋白(PV)，其分子量為10～12 kDa，穩(wěn)定性極強[5-6]。

目前，食品過敏原消除技術(shù)主要有熱處理[7]、蛋白酶水解[8]、超高壓[9]等。Sletten等[10]利用腌制、煙熏等化學(xué)處理方法，降低了魚過敏原的IgE結(jié)合能力，但會產(chǎn)生具有IgE結(jié)合能力的新蛋白和亞硝胺等有害物質(zhì)。李振興等[11]研究表明，經(jīng)熱蒸加工后，大菱鲆魚蛋白質(zhì)與lgE結(jié)合能力減弱，但會出現(xiàn)一個新的8 kDa的蛋白與IgE結(jié)合。董曉穎等[12]發(fā)現(xiàn)用風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶處理后的蝦過敏原其致敏性幾乎消失，但會破壞水產(chǎn)品性狀，產(chǎn)品應(yīng)用面窄，難以大范圍推廣。陸海霞等[13]發(fā)現(xiàn)超高壓可以使魷魚肌動蛋白、肌球蛋白重鏈等聚集交聯(lián)，但這種交聯(lián)也有可能暴露IgE結(jié)合位點；此外，超高壓技術(shù)只能改變蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，不能改變一級結(jié)構(gòu)，而且運行成本昂貴。

美拉德反應(yīng)通過糖基修飾過敏原，改變或破壞過敏原的抗原表位，進而降低其致敏性[14-15]。李慶麗等[16]發(fā)現(xiàn)麥芽糖可使蝦過敏原的免疫活性降低60%。李錚[17]用還原糖和純化后草魚小清蛋白反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)小清蛋白致敏活性也顯著降低。美拉德反應(yīng)是少數(shù)可以在生產(chǎn)中實現(xiàn)的海水魚過敏原消除技術(shù)，目前尚未見利用美拉徳反應(yīng)消除鱈魚中過敏原的報道。美拉德反應(yīng)會產(chǎn)生大量成色物質(zhì)，使產(chǎn)品感官變差[18]。

試驗擬以鱈魚為試驗對象，探究不同還原糖、熱處理溫度以及加工方式對脫除小清蛋白效果的影響，并應(yīng)用于鱈魚的低致敏性加工工藝中，以期為低致敏性的、健康的海水魚食品的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

鱈魚：市售；

Maker：無錫浮云生物技術(shù)有限公司；

明膠：西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；

三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、丙烯酰胺：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

IgG抗蛙小清蛋白單克隆抗體(PARV-19)、HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG 抗體：自制；

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

凍干機：GIPP-5000FDA型，美國Labconco公司；

電泳儀：DYY-6C型，北京市六一儀器廠；

分光光度計：UV-2100型，上海尤尼柯儀器有限司；

凝膠成像儀：Gel Doc XR+型，南京溯遠(yuǎn)基因科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小清蛋白(PV)的熱提取 稱取20 g鱈魚于燒杯中，加入180 mL PBS溶液，電動攪拌15 min，100 ℃水浴10 min，冷卻，離心，上清液倒于培養(yǎng)皿，用扎有一定密度小孔的保鮮膜封住，冷凍干燥12～24 h，得小清蛋白粗提物，從培養(yǎng)皿內(nèi)刮取備用[19-20]。

1.2.2 還原糖種類優(yōu)化 參考蔡秋鳳等[19]的方法修改如下：準(zhǔn)確稱量質(zhì)量比為1∶1∶1的葡萄糖、木糖和果糖溶解于2 mL水中(還原糖質(zhì)量為12.5 mg)備用。準(zhǔn)確稱取50 mg熱提粗蛋白，加入2 mL水溶解，加糖溶液，100 ℃水浴30 min，得美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRPs)，測定其PV含量。

1.2.3 美拉德反應(yīng)溫度優(yōu)化 參考楊汝晴[20]的研究方法修改如下：準(zhǔn)確稱取1.2.2中消除效果最好的還原糖12.5 mg溶于1 mL溫水中，備用；準(zhǔn)確稱取蛋白粗提物50 mg溶解，完全溶解后加糖溶液，控制樣品體積為4 mL。于60，85，100，121，170 ℃下恒溫反應(yīng)，得不同反應(yīng)條件下的MRPs，測定其PV含量。

1.2.4 還原糖加入方式優(yōu)化

(1) 注射法：取長、寬、高分別約為5，2，3 cm塊狀魚肉20 g，取1.2.2中消除效果最好的還原糖0.5 g配成1 mL的糖溶液，用微量注射器在魚肉的長、寬表面上每3 cm3注射一次，放置2 h，使用最優(yōu)溫度恒溫反應(yīng)30 min，得美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。參照1.2.1提取小清蛋白，并測定其含量。

(2) 腌制法：操作步驟同(1)，將還原糖的添加方式由注射改成“直接添加，腌制2 h”。

1.2.5 美拉德反應(yīng)消除小清蛋白的應(yīng)用

(1) 改良工藝：魚去鱗、去內(nèi)臟，洗凈，晾干。取魚肉500 g，加入花椒50 g、辣椒粉65 g、醬油50 g，鹽300 g。取1.2.2篩選的還原糖2.5 g配成溶液，使用最優(yōu)加工方式加入，腌制6 h后洗凈，最優(yōu)溫度處理2 d，即得魚干，提取小魚干的小清蛋白，并測定其含量。

(2) 傳統(tǒng)工藝：不加入糖溶液直接溫度處理，其他操作步驟同1.2.5(1)。

1.2.6 PV含量分析

(1) SDS-PAGE電泳：對MRPs進行電泳，通過Image J軟件分析電泳條帶，可得小清蛋白的相對含量。

(2) ELISA酶聯(lián)反應(yīng)：用標(biāo)準(zhǔn)小清蛋白進行酶聯(lián)反應(yīng)，顯色后測定吸光度，繪圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進行ELISA酶聯(lián)反應(yīng)，顯色后測定吸光度，平行試驗數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得MRPs中小清蛋白絕對含量[21-22]。

(3) 美拉德反應(yīng)程度：取MRPs稀釋5倍，測定420 nm處吸光度。

(4) 感官評價：由10人組成的感官評定小組，按表1對MRPs的色澤、氣味進行評分。

表1 感官評定對應(yīng)指標(biāo)參考詞匯Table 1 Sensory evaluation related indicators reference vocabulary

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗平行測定3次，采用Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用SPSS 22.0軟件進行顯著性分析。利用Image J軟件進行圖像處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小清蛋白粗提物的SDS-PAGE電泳

由圖1可知，小清蛋白分子量為10～12 kDa，其在粗提物中的相對含量為29.71%。小清蛋白熱穩(wěn)定較好，熱提取對其性質(zhì)無影響，但會使部分其他蛋白質(zhì)變性。

2.2 還原糖種類篩選

2.2.1 小清蛋白相對含量 由圖2可知，各泳道內(nèi)的蛋白質(zhì)種類較圖1的少，除小清蛋白質(zhì)外，其他蛋白質(zhì)種類依然較多，且小清蛋白條帶并未消失，熱提取并不能完全消除小清蛋白，但能使部分其他蛋白變性。木糖、葡萄糖、果糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的小清蛋白相對含量分別為19.6%，25.5%，21.3%，進一步表明相對應(yīng)的還原糖對小清蛋白的消除能力大小為木糖>果糖>葡萄糖。

1. 小清蛋白粗提物 M. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白Maker圖1 小清蛋白粗提物電泳圖Figure 1 Electrophoresis of parvalbumin crude extract

2.2.2 小清蛋白絕對含量及其他指標(biāo) 由表2可知，美拉德反應(yīng)越劇烈，其反應(yīng)產(chǎn)物顏色越深，吸光度值越大；還原糖的反應(yīng)程度次序為木糖>果糖>葡萄糖，對應(yīng)的MRPs感官評分為60，30，30。輕度美拉德反應(yīng)會產(chǎn)生適量成色物質(zhì)及濃郁芳香，木糖與小清蛋白反應(yīng)強度最高，其MRPs棕黃，感官評分最高。木糖、葡萄糖、果糖MRPs小清蛋白絕對含量分別為263，345，289 μg/mL，進一步表明相對應(yīng)的糖類的消除效果為木糖>果糖>葡萄糖。

1. 木糖與小清蛋白MRPs 2. 葡萄糖與小清蛋白MRPs 3. 果糖與小清蛋白MRPs M. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白Maker

圖2 還原糖與小清蛋白反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖

Figure 2 Electrophoresis of MRPs of reducing sugars and parvalbumin

表2 還原糖與小清蛋白反應(yīng)的各項指標(biāo)?Table 2 Various indicators of MRPs of reducing sugars and parvalbumin

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 溫度對消除小清蛋白的影響

2.3.1 小清蛋白相對含量 由圖3可知，60，85，100，121，170 ℃美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中小清蛋白相對含量分別為22.2%，21.4%，19.1%，16.5%，11.2%。小清蛋白含量隨溫度的升高逐漸降低，且100 ℃以下小清蛋白含量的減少幅度小于100 ℃以上的，說明100 ℃以下進行的美拉德反應(yīng)更溫和、緩慢。

1. 60 ℃ 2. 85 ℃ 3. 100 ℃ 4. 121 ℃ 5. 170 ℃ M. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Maker

圖3 不同溫度下木糖與小清蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖

Figure 3 Electrophoresis of MRPs of xylose and parvalbumin at different temperatures

2.3.2 小清蛋白絕對含量及其他指標(biāo) 由表3可知，隨著溫度的升高，MRPs吸光度逐漸升高，美拉德反應(yīng)越劇烈。60，85，100，121，170 ℃下的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物感官評分分別為10，10，60，40，30。隨著溫度的升高，產(chǎn)物顏色呈現(xiàn)比較誘人的黃色，氣味轉(zhuǎn)變?yōu)槿忉u味，但溫度升高至一定程度后，MRPs顏色偏棕色，氣味開始變焦，當(dāng)溫度為100 ℃時感官評分最高。MRPs中小清蛋白的絕對含量分別為302，291，223，185，50 μg/mL，說明隨著溫度的增加，小清蛋白殘余量減少。綜上，當(dāng)溫度為100 ℃時，木糖與小清蛋白的反應(yīng)產(chǎn)物感官較好且小清蛋白含量較低。

2.4 加工方式對消除小清蛋白的影響

2.4.1 小清蛋白相對含量 由圖4可知，注射加工和腌制加工的MRPs中小清蛋白相對含量分別為9.9%，16.2%，說明注射加工方式能使木糖和魚肉反應(yīng)得更加充分。注射處理的小清蛋白殘余量低于腌制處理的，其MRPs小清蛋白的電泳條帶更淡。

表3 不同溫度下木糖與小清蛋白美拉徳反應(yīng)產(chǎn)物的各項指標(biāo)?Table 3 Various indicators of MRPs of xylose and parvalbumin at different temperatures

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

1. 腌制加工 2. 注射加工 M. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Maker圖4 不同加工方式下木糖與魚肉美拉德反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖Figure 4 Electrophoresis of MRPs of xylose and fish under different processing methods

2.4.2 小清蛋白絕對含量及其他指標(biāo) 由表4可知，注射加工的小清蛋白與木糖反應(yīng)程度低于腌制加工的，兩種反應(yīng)產(chǎn)物的感官評分均為40；經(jīng)注射加工和腌制加工的反應(yīng)產(chǎn)物中小清蛋白殘余量分別為134，212 μg/mL，說明注射加工的小清蛋白殘余量明顯少于腌制加工的。

2.5 小清蛋白消除技術(shù)對魚干致敏性的影響

2.5.1 小清蛋白相對含量 由圖5可知，泳道1，2的條帶數(shù)目無明顯差別，說明兩種工藝條件下小魚干的蛋白質(zhì)類別均較少。傳統(tǒng)工藝和改進工藝的小魚干小清蛋白相對含量分別為6.08%，5.78%，說明傳統(tǒng)工藝的小魚干中小清蛋白較少，但經(jīng)改良工藝的小清蛋白殘余量低于傳統(tǒng)工藝的。

表4 不同加工方式下木糖與魚肉美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的各項指標(biāo)?Table 4 Various indicators of MRPs of xylose and fish under different processing methods

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

1. 傳統(tǒng)工藝 2. 改進工藝 M. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Maker圖5 不同工藝下木糖與魚肉美拉德反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖Figure 5 Electrophoresis of MRPs of xylose and fish using different techniques

2.5.2 小清蛋白絕對含量及其他指標(biāo) 由表5可知，改良工藝的美拉德反應(yīng)程度低于傳統(tǒng)工藝的，二者的感官評分無明顯區(qū)別。傳統(tǒng)工藝和改良工藝下木糖與小清蛋白MRPs中小清蛋白的絕對含量分別為81，75 μg/mL，說明改良工藝的小魚干蛋白提取物中的小清蛋白殘余量少于傳統(tǒng)工藝的。

3 結(jié)論

利用美拉德反應(yīng)，探究了還原糖種類、反應(yīng)溫度、還原糖添加方式等因素對消除小清蛋白效果的影響。結(jié)果表明，還原糖對小清蛋白的消除效果為木糖>果糖>葡萄糖；隨著反應(yīng)溫度的升高，感官評分先增加后降低，小清蛋白殘余量越來越少；注射加入還原糖的小清蛋白消除效果優(yōu)于腌制的。低致敏性、健康的海水魚食品生產(chǎn)的最優(yōu)工藝參數(shù)為使用注射加工方法，于100 ℃時加入木糖，將該條件應(yīng)用于鱈魚魚干的生產(chǎn)工藝中，可得到低致敏性產(chǎn)品。后續(xù)可探討其他海水魚類的脫敏技術(shù)。

表5 不同工藝下木糖與魚肉美拉德反應(yīng)的各項指標(biāo)?Table 5 Various indicators of MRPs of xylose and fish MRPs using different techniques

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。