陳雪影 柴文君 葉彩燕

摘 要：為了評估復方杜仲提取物對海鱸夏季高溫期以肝腫大為特征的消化系統(tǒng)癥狀修復作用，將150尾健康海鱸設置3個平行，每個平行隨機分5組（1個常溫組、4個高溫組），常溫組和高溫組分別在（27±0.5）℃、（33±0.5）℃處理2周。試驗期間飽食投喂普通飼料，2周后高溫組肝臟出現(xiàn)了肝細胞腫脹、空泡變性等組織病變，對高溫組分別投以0、1∶6、1∶4、1∶2復方杜仲提取物水平的飼料，常溫組投喂普通飼料，2周后高溫組血清谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）含量均顯著降低（P<0.05）;且下降幅度隨中草藥添加量增加而增大，1∶2試驗組ALT和AST均極顯著低于高溫對照組（P<0.01）;病理組織學結果顯示，高溫組肝細胞損傷修復程度與復方杜仲提取物比例成正相關。因此，復方杜仲提取物對高溫期海鱸肝臟病變具有修復作用，且1∶2試驗組效果最好。

關鍵詞：海鱸;高溫期;消化系統(tǒng)疾病;病理模型;杜仲提取物

Abstract： In order to evaluate the effect of Eucommia ulmoides extract on repair the hepatomegaly on sea bass because of the high temperature in summer. 150 healthy sea bass were divided into three parallel treatments， which were randomized in one normal temperature group and four high temperature groups. Normal temperature group were treated at the room temperature （（27±0.5）℃）while high temperature groups at the high temperature（（33±0.5）℃）for two weeks. Two weeks later， symptoms such as hepatocyte tumefaction， vacuolation， stenosis of sinus were observed on the pathological histological section in high temperature groups. Then the high temperature groups were fed for 0 （control）， 1∶6， 1∶4， 1∶2 commercial feed diets containing Eucommia ulmoides extract and the normal temperature group was feed for ordinary commercial feed for two weeks. The serum alanine aminotransferase （ALT） and aspartate aminotransferase （AST） were significant decreased （P<0.05） and the decreasing extent with Eucommia ulmoides extract increasing， and the addition of 1∶2 decreased most. Besides， the histopathological results showed that the restorative effects had positively correlation with amount of Eucommia ulmoides extract， which could alleviate the pathological damage of liver. In summary， eucommia ulmoides extract has prominent repair effect on the liver lesions of sea bass， and addition of 1∶2 is the most obvious.

Key words： Sea bass; High temperature period; Digestive symptoms; Pathological model; Eucommia ulmoides

據(jù)統(tǒng)計，2018年廣東海水鱸魚池塘養(yǎng)殖面積達6667hm2，產量超20萬t，海鱸已成為全國性海水養(yǎng)殖主導品種之一[1]。近年來，實踐發(fā)現(xiàn)，海鱸精養(yǎng)區(qū)夏季高溫期間，海鱸容易出現(xiàn)加料難、階段料比高等問題，解剖發(fā)現(xiàn)海鱸肝腫大發(fā)白成為共性癥狀，病理學特征方面主要表現(xiàn)肝細胞空泡變性，肝血竇出現(xiàn)擠壓性竇腔狹窄，未見紅細胞和白細胞浸潤等。海鱸上述肝臟問題持續(xù)1～3個月，期間可引起魚體食欲減退，營養(yǎng)吸收效率低，生長緩慢，免疫水平降低，輕則引起零星死亡，嚴重時極易結合細菌、病毒等暴發(fā)大規(guī)模疾病，嚴重影響海鱸養(yǎng)殖經濟效益。

肝臟是魚類的重要實質器官，與機體消化、解毒、免疫和代謝等功能密切相關[2-4]。養(yǎng)殖環(huán)境變化、流行性病害、藥物濫用、投喂不當?shù)染鶗斐婶~體肝臟的病變[3-7]。肝臟作為重要的消化器官，其損傷會引起料比高，消化吸收能力減弱，免疫系統(tǒng)紊亂，導致魚體抗病力下降等，進而引發(fā)一系列的養(yǎng)殖問題的出現(xiàn)[4-6]。溫度是影響魚類生長發(fā)育的重要因素之一，眾多研究表明，高溫脅迫造成虹鱒、石斑魚、牙鲆、大黃魚等生長率、存活率降低，引發(fā)肝臟損傷，甚至死亡[8-12]。夏季高溫加上投喂過度則更易引發(fā)肝臟損傷，影響魚類健康生長。目前，對魚類肝臟疾病的研究，主要集中在草魚、青魚、羅非魚等淡水經濟魚類上，包括發(fā)病癥狀、發(fā)病原因、發(fā)病規(guī)律、不同藥物治療效果等，如脂肪肝、毒性和藥源性物質引發(fā)的肝中毒等[3-5]。鱸魚類僅大口黑鱸、梭鱸有相關研究，孫永旭等從免疫學角度研究發(fā)現(xiàn)長期高溫脅迫對大口黑鱸幼體產生應激損傷，并且肝臟對溫度脅迫更敏感，王國成研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫造成梭鱸肝臟損傷[13-14]。海鱸僅涉及對養(yǎng)殖過程中常見病害的病原病因分析和防治建議等基礎研究，尚未見從病理組織學和免疫學角度去研究海鱸肝臟疾病及防治效果的相關報道。因此，探尋防治魚類肝膽疾病的有效藥物具有非常重要的意義。本研究通過高溫脅迫構建海鱸肝臟損傷模型，對模型組投喂以添加不同濃度復方杜仲提取物的商品飼料，從組織病理學和免疫學層面探討中草藥制劑防治的有效性，為研究中草藥制劑作為海鱸保肝藥物的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試驗魚 試驗用海鱸購自珠海市斗門區(qū)一精養(yǎng)池塘，共150尾，平均體重（100.0±5.0）g。海鱸全價商品飼料購自市場，產品主要成分見表1。含復方杜仲提取物中草藥制劑是廣東海大集團股份有限公司自主研制及生產的專利產品。血清谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）酶采用試劑盒進行測定，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 試驗養(yǎng)殖管理 養(yǎng)殖用水為經全循環(huán)系統(tǒng)曝氣凈化的自來水。試驗期間持續(xù)增氧，水體pH7.0～7.8，水溫27℃，溶解氧7.0～8.0mg/L，每天上、下午各投餌1次（10∶00、16∶00），試驗期間飽食投喂。

1.2.1 試驗分組及高溫模型的構建 試驗組分為1個常溫組（27±0.5℃）和4個高溫組（33±0.5℃），每組3個平行，10尾/組，各飼養(yǎng)在容積為200L的圓柱形水族箱中。室溫（27±0.5）℃進行暫養(yǎng)5d后，高溫組加入加熱棒，使水體以1℃/d的速度升溫，升至（33±0.5）℃后維持2周，常溫組不升溫，造模期間各組均投喂海鱸全價商品飼料。

1.2.2 投喂復方杜仲提取物中草藥制劑 基于前期預試驗結果，造模2周后，每組隨機選取一平行全部解剖，取樣做病理組織切片分析。確定已成功構建海鱸肝臟病理損傷模型后，將高溫組分為高溫對照組和3個試驗組，普通組不變。常溫組和高溫對照組投喂常規(guī)配合飼料，高溫試驗組投喂常規(guī)配合飼料和中草藥飼料混合物，中草藥制劑和常規(guī)飼料比例分別為1∶6、1∶4和1∶2。高溫組（33±0.5）℃、常溫組（27±0.5）℃繼續(xù)維持2周。

1.3 樣品采集及肝組織病理組織學觀察 試驗結束后，禁食24h，每組隨機取3尾魚用于尾靜脈采血，靜置4h后以4000rpm/min、4℃條件下離心10min，收集血清，試劑盒檢測谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）含量。同時取魚的肝臟制作組織切片，光學顯微鏡觀察組織切片。

1.4 數(shù)據(jù)處理 試驗結果以平均值±標準誤差形式表示。采用SPSS統(tǒng)計學軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，差異具有統(tǒng)計學意義的標準為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 海鱸肝臟損傷模型 造模2周后，與常溫組相比，高溫組肝組織均出現(xiàn)一定程度的病理特征：肝細胞腫脹、體積增大、胞漿染色變淺、空泡變性、肝血竇狹窄、血細胞減少（圖1 A1-A2）。

2.2 投喂不同比例的復方杜仲提取物中草藥對海鱸肝臟修復的影響

2.2.1 肝臟組織形態(tài) 投喂復方杜仲提取物中草藥制劑后，與高溫對照組比較，各高溫試驗組肝組織均出現(xiàn)不同程度好轉，其中1∶2試驗組的肝組織修復效果最好。1∶6和1∶4試驗組肝組織結構正常，肝細胞的損傷程度有所降低，空泡變性的程度減輕，肝細胞血竇血流量正常（圖1 B1-B2）;1∶2試驗組肝血竇豐度較高，肝內血流量大，肝細胞形態(tài)整體符合正常范圍（圖1 C1-C2）。

2.2.2 血清轉氨酶檢測結果 由表2可知，添加復方杜仲提取物2周后，海鱸血清谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）含量均呈降低趨勢，且下降幅度隨中草藥添加量增加而增大，1∶2試驗組ALT和AST均極顯著低于高溫對照組（P<0.01），與常溫組差距最小。1∶4試驗組ALT和AST雖與高溫對照組相比有顯著差異，但與常溫組差距較大。因此，1∶2試驗組修復效果最好。

3 討論

肝臟是魚類重要的消化、免疫、代謝、解毒器官，在集約化養(yǎng)殖的情況下，肝臟疾病的發(fā)生已成為限制水產養(yǎng)殖快速、健康發(fā)展的重要問題[3-7]。閆少靜、汪開毓、介子林等研究表明，肝臟損傷或病變往往會引起魚類免疫系統(tǒng)紊亂、抗病力下降，并極易引發(fā)其他疾病暴發(fā)，造成魚類大量死亡[4-6]。肝臟是機體內代謝最為旺盛的組織器官之一，Lushchak研究表明熱應激可使肝臟氧化還原反應明顯增強，進而產生大量活性氧造成肝細胞損傷，李大鵬、童娜等發(fā)現(xiàn)對損傷的適應性反應常引起細胞結構改變，當細胞膜通透性改變、細胞內水分增加時，即出現(xiàn)細胞腫脹、水泡變性，所以長期高溫容易引發(fā)魚類肝臟疾病[15-17]。管標、Aboka、李佳凱等研究表明虹鱒、鳙魚、大黃魚等受到高溫脅迫后，應激反應強烈，肝臟發(fā)生損傷[11，18-19]。汪開毓、周寧、杜震宇等對魚類肝臟疾病分析發(fā)現(xiàn)，飼料投喂不當，包括蛋白質含量過高、維生素缺乏、投喂過度等，也是引發(fā)肝臟疾病的一類重要原因[2，4，20]。本試驗結果顯示，高溫期間飽食投喂能夠引發(fā)海鱸肝臟損傷，主要病理組織學癥狀為肝細胞腫大、肝細胞發(fā)生空泡變性。

Aboka、邵彥翔等研究表明急性細胞腫脹是一種早期的、完全可逆的損傷[9，19]。中草藥因其療效好、無殘留等優(yōu)點，開發(fā)對肝臟具有保護作用的中草藥是目前研究的熱點[21，24]。農業(yè)部推薦養(yǎng)殖生產中使用的GMP中草藥有多種，多用于抗菌治療，且存在普適性、對癥性差等弊端。劉英娟、白潔、謝炎福等研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖、葉下珠、當歸提取物、甘草提取物、黃芪提取物、姜黃素、黃芩、垂盆草等對肝臟具有良好的保護和損傷修復效果[23，25-27]。但目前這些研究成果多停滯在基礎理論研究層面，距離快速實現(xiàn)產品化及投入市場應用還很遙遠。所以解決此類肝臟疾病對于推動水產行業(yè)的健康發(fā)展具有重大意義。杜仲是我國特有的經濟林資源和名貴藥材，其化學成分多樣且復雜，生物活性廣泛，具有保肝護腎、抗炎、提高生長性能等藥理作用[28-31]。近年來，關于杜仲修復肝細胞、調節(jié)養(yǎng)殖動物免疫作用的報道在畜禽和淡水魚方面報道較多，羅慶華、高銀輝、王建輝等研究表示添加杜仲提取物能提高機體免疫應答水平，增強抗肝細胞損傷、抗纖維化、抗細菌感染能力，而在特種魚方面相關很少[32-36]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，內服復方杜仲提取物后，肝細胞組織顯著得到改善，肝細胞形態(tài)恢復正常，肝細胞排列整齊，血竇豐度正常。而且這種防治效果隨著復方杜仲提取物添加量增加而提高，這將更有利于肝臟發(fā)揮正常的生理機能，更能促進海鱸的免疫功能及消化吸收進行。免疫學檢測指標亦顯示，復方杜仲提取物能顯著對抗肝損傷海鱸血清中ALT、AST水平的升高，并呈現(xiàn)明顯的劑量相關性。試驗結果表明復方杜仲提取物對肝臟受損海鱸具有明顯的保護作用，孫黎清、戚向陽、劉慧等對其有效成分分析發(fā)現(xiàn)，這可能與杜仲所含有的一些化學活性成分如苷類、生物堿、多糖等有關，因為上述活性成分均具有調節(jié)動物機體免疫作用[29-30，37]。

4 結論

試驗結果表明，飼料中添加復方杜仲提取物對受損海鱸肝組織有修復作用，還能顯著降低血清ALT和AST活性。因此，復方杜仲提取物對受損海鱸肝臟有保護作用，并具有促進機體免疫機能恢復作用，可以作為一種保肝制劑。

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