周興艷，李華，柳茜，羅欣月，陳燁，朱春玲，嚴(yán)瑞

(貴州醫(yī)科大學(xué)附院 腎臟內(nèi)科，貴州 貴陽 550004)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)的主要原因[1]。研究發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥是促進(jìn)DN進(jìn)展的重要危險(xiǎn)因素[2-3]。細(xì)胞焦亡，是一種可由半胱天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)介導(dǎo)的炎性程序性溶解性細(xì)胞死亡，而Gasdermin家族成員GSDMD是引起細(xì)胞焦亡發(fā)生的最終執(zhí)行者，細(xì)胞焦亡的發(fā)生與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[4-5]。本研究以DM小鼠為研究對(duì)象，觀察Caspase-1及細(xì)胞焦亡關(guān)鍵蛋白GSDMD及其mRNA表達(dá)變化，為探索糖尿病腎病細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)的機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

SPF級(jí)C57BL/6J小鼠(雄性)，體質(zhì)量(18±1.2)g【斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2016-0002】；鏈脲佐菌素(STZ，美國，Sigma公司)、血糖儀及血糖試紙(上海魚躍生物技術(shù)有限公司)、預(yù)染Marker(Thermo Scientific公司)、rabbit-anti-β-actin(博奧森生物技術(shù)有限公司)、rabbit-anti-caspase-1(Proteintech公司)、rabbit-anti-GSDMD(Abcam公司)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(普美生物技術(shù)有限公司)。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、HE及Masson染色試劑盒(北京索萊寶公司)，總 RNA提取試劑盒(天根生化科技公司)、引物合成 (Thermo Scientific公司)、Real Time-PCR試劑盒(Takara公司)以及生化指標(biāo)由成都里來生物技術(shù)有限公司提供技術(shù)支持。

1.2 方法

1.2.1分組及DM小鼠模型復(fù)制 將6～8周齡的C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)和糖尿病小鼠模型組(DM組)，每組6只。將DM組小鼠禁食(不禁飲)3～4 h，以1%鏈脲佐菌素(STZ)按55 mg/kg劑量(檸檬酸鈉緩沖液配制)腹腔注射，正常組小鼠以等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射，連續(xù)注射5 d，造模結(jié)束72 h后測(cè)定DM組小鼠空腹尾靜脈末梢血糖均>16.7 mmol/L，造模成功后繼續(xù)飼養(yǎng)16周。

1.2.2生化指標(biāo)測(cè)定及腎臟組織觀察 將NC組和DM組飼養(yǎng)16周后乙醚麻醉處死，眼球取血離心后取上清檢測(cè)血糖及血肌酐；經(jīng)小鼠左心室予4 ℃預(yù)冷的0.9%生理鹽水灌洗腎臟，取一側(cè)腎臟組織存于1.5 mL離心管中凍存-80 ℃冰箱備用，另一側(cè)腎臟組織立即放入4%多聚甲醛中固定、制成3 μm厚的石蠟切片,行HE和Masson染色進(jìn)行病理學(xué)觀察，并拍攝圖片。

1.2.3檢測(cè)Caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá) Western blot法檢測(cè)Caspase-1、GSDMD的蛋白表達(dá)，取小鼠腎皮質(zhì)部分加入組織蛋白裂解液后組織勻漿，離心后取上清，按照BCA試劑盒說明書測(cè)定蛋白濃度；各組蛋白上清加入5×蛋白上樣緩沖液加熱變性后加至SDS-PAGE凝膠中，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉后，分別用對(duì)應(yīng)一抗β-actin(1 ∶6 000)、Caspase-1(1 ∶1 000)、GSDMD(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000)，室溫孵育1.5 h，再次TBST洗膜3次，應(yīng)用ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)顯影拍照，重復(fù)3次以上，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4檢測(cè)Caspase-1、GSDMDmRNA的表達(dá) Real Time-PCR法檢測(cè)Caspase-1、GSDMD的mRNA表達(dá)。應(yīng)用Trizol法提取小鼠腎組織的總RNA并測(cè)定其濃度，步驟參照試劑盒說明書；選取20 μL作為反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系合成模板cDNA，應(yīng)用Thermo Scientific公司提供的PCR引物，采用SYBR premix Ex TaqII進(jìn)行熒光定量PCR。目的基因引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列Tab.1 The sequences of the primers in real time PCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 生化指標(biāo)測(cè)定

與NC組比較，DM組小鼠血糖水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；且在DM組小鼠腎功能指標(biāo)血肌酐水平較NC組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示造模成功，見表2。

表2 兩組小鼠血糖、血肌酐水平Tab.2 Levels of blood glucose and plasma creatinine in the two

注：與NC組比較，(1)P<0.01，(2)P<0.05。

2.2 小鼠腎組織變化

光鏡下，HE染色可見NC組小鼠腎小球形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰，腎小管未見明顯擴(kuò)張、變性及壞死，基底膜完整；DM組小鼠見腎小球內(nèi)系膜基質(zhì)增生，部分腎小管上皮細(xì)胞完整性被破壞，可見細(xì)胞腫脹、空泡變性(圖1A)。Masson染色下顯示，NC組小鼠腎小球基底與系膜區(qū)未見膠原沉積，腎小管間質(zhì)區(qū)未見膠原增多；DM組小鼠腎組織中可見部分腎小管管腔擴(kuò)張，腎小管基底膜增厚，腎小球內(nèi)可見大量被染成藍(lán)紫色條索狀的膠原纖維沉積(圖1B)。

注：A為HE染色，B為Masson染色。圖1 NC組和DM組小鼠腎組織變化(HE和Masson染色)Fig.1 Histological changes of kidney tissues mouse in two groups (HE and Masson)

2.3 腎組織中Caspase-1和GSDMD的蛋白表達(dá)

與NC組相比，DM組小鼠腎臟組織中Caspase-1及GSDMD蛋白表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

注：(1)與NC組比較，P<0.05。圖2 NC和DM組小鼠腎組織中Caspase-1及GSDMD蛋白的表達(dá)(Western blot)Fig.2 The protein expression of Caspase-1 and GSDMD in kidney tissues of normal controls and diabetic groups(Western blot)

2.4 腎組織中Caspase-1和GSDMDmRNA表達(dá)

與NC組相比，DM組小鼠腎臟組織中Caspase-1和GSDMDmRNA的表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,n=6)，見圖3。

注：(1)與NC組比較，P<0.05。圖3 腎組織中Caspase-1和GSDMD mRNA表達(dá)(Real Time PCR)Fig.3 The mRNA expression of Caspase-1 and GSDMD in kidney tissues in two groups(Real Time PCR)

3 討論

DN逐漸成為我國終末期腎臟病患者的主要病因之一，其防治機(jī)制的研究一直以來備受關(guān)注[1]。本研究發(fā)現(xiàn)，C57BL/6J小鼠在STZ誘導(dǎo)下發(fā)生血糖增高，長時(shí)間高血糖狀態(tài)，DM小鼠逐漸出現(xiàn)腎臟損傷，其病理表現(xiàn)為小鼠腎小球內(nèi)系膜基質(zhì)增生及膠原纖維沉積，部分腎小管上皮細(xì)胞完整性被破壞，可見細(xì)胞腫脹、空泡變性，這與既往研究結(jié)果類似[6]，可見持續(xù)高血糖狀態(tài)是引起DN發(fā)生的因素之一。而近年研究表明，慢性炎癥逐漸成為促進(jìn)DN進(jìn)展的主要因素之一，并發(fā)現(xiàn)抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)/Caspase-1/白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)通路可改善糖尿病腎損傷，這可能是一種預(yù)防DN進(jìn)展的潛在治療策略[7]，但目前針對(duì)糖尿病腎病炎癥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，故對(duì)其發(fā)生的防治缺乏相對(duì)有效的治療手段。因此，探索DN炎癥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制，將為DN的防治研究提供作用靶點(diǎn)奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

細(xì)胞焦亡是由炎性Caspases如人同源性和鼠同源性Caspase-1、人同源性Caspase-4 及 Caspase-5或鼠同源性Caspase-11激活的炎性程序性細(xì)胞死亡方式，而具有“膜孔形成效應(yīng)”的Gasdermin家族成員GSDMD是引起細(xì)胞焦亡發(fā)生的底物蛋白[4-5]。而細(xì)胞焦亡的發(fā)生形式可分為經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑兩種類型：由炎癥小體激活的人同源性和鼠同源性Caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞死亡為經(jīng)典途徑細(xì)胞焦亡，由人同源性Caspase-4、Caspase-5或鼠同源性Caspase-11直接介導(dǎo)的細(xì)胞死亡稱為非經(jīng)典途徑細(xì)胞焦亡[8]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡的發(fā)生涉及細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物如炎癥細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而引起細(xì)胞周圍炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，作為炎性Caspases的底物蛋白GSDMD是引起這一過程發(fā)生的必需基因[8-10]。目前針對(duì)DN細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)的機(jī)制研究尚不完全清楚。目前針對(duì)細(xì)胞焦亡是否能作為DN炎癥反應(yīng)防治的突破點(diǎn)也鮮有研究報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，在DM小鼠腎組織中活性Caspase-1的蛋白及mRNA表達(dá)增高，這一結(jié)果與既往研究結(jié)果類似：活性Caspase-1是促炎性細(xì)胞因子分泌、細(xì)胞焦亡、炎癥介導(dǎo)免疫所必需的，Caspase-1蛋白前體(protein precursor-caspase-1,Pro-caspase-1)是炎癥小體的重要組成部分，由炎癥小體激活Pro-caspase-1進(jìn)一步裂解產(chǎn)生的活性Caspase-1可分解促炎性細(xì)胞因子如IL--1β和IL--18的蛋白前體，產(chǎn)生并控制成熟炎癥細(xì)胞因子的分泌和介導(dǎo)一種稱為細(xì)胞焦亡的炎性細(xì)胞死亡[11]。Shahzad等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病小鼠(db/db小鼠)模型及高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中，檢測(cè)到Caspase-1的表達(dá)高于凋亡標(biāo)記物(Caspase-3、Caspase-7、PARP1)的表達(dá)水平，Caspase-1依賴性炎癥小體激活可促進(jìn)DN發(fā)生發(fā)展，小分子靶向Caspase-1或炎癥小體活化可能是DN的一種可行的治療途徑。高糖誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細(xì)胞可發(fā)生細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)沉積，且發(fā)現(xiàn)Caspase-1的表達(dá)水平增高，紅景天苷(salidroside,SAL)是玫瑰紅景天中的主要成分，對(duì)DN有保護(hù)作用，可抑制硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)的表達(dá)，從而可抑制Caspase-1參與的NLRP3炎癥小體活化，進(jìn)而抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激和減輕ECM沉積[13]。而腎小管間質(zhì)炎癥在DN的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，Optineurin(OPTN)的表達(dá)減少可促進(jìn)DN病程進(jìn)展；過表達(dá)OPTN的鼠腎小管上皮細(xì)胞中NLRP3表達(dá)明顯降低，且抑制Caspase-1和IL-1β的裂解以及炎癥因子IL-1β和IL-18的釋放，顯著增加了腎小管上皮細(xì)胞中微管相關(guān)蛋白1A / 1B-輕鏈3-II和線粒體外膜20的轉(zhuǎn)位酶的共配作用，進(jìn)而表明OPTN通過增強(qiáng)線粒體吞噬作用，抑制Caspase-1活化，減輕腎小管間質(zhì)炎癥反應(yīng)[14]。姜黃素作為一種有效的抗纖維化劑，可抑制DN小鼠腎組織和高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中膠原IV、纖連蛋白、Caspase-1和NLRP3的表達(dá)，減輕腎小球肥大、腎小球系膜基質(zhì)增生，降低蛋白尿的排泄[15]。A1腺苷受體(A1 adenosine receptor,A1AR)通過抑制DN中與細(xì)胞焦亡相關(guān)的Caspase-1 / IL-18信號(hào)傳導(dǎo)，在近端腎小管巨蛋白丟失相關(guān)蛋白尿中起保護(hù)作用[16]。以上研究表明，活性Caspase-1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡可促進(jìn)DN的發(fā)生發(fā)展。

同時(shí)，本次研究中發(fā)現(xiàn)DM小鼠腎組織中GSDMD蛋白及mRNA表達(dá)增高。已有研究報(bào)道，細(xì)胞焦亡不僅可發(fā)生在固有免疫細(xì)胞中，而且在腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞中也可出現(xiàn)，與腫瘤、免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[17-19]。既往研究顯示，GSDMD是細(xì)胞焦亡和分泌促炎性細(xì)胞因子的關(guān)鍵蛋白[20]。在髓系細(xì)胞或巨噬細(xì)胞中抑制GSDMD活性可抑制細(xì)胞焦亡及促炎性細(xì)胞因子的釋放[21-22]。高糖誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中Caspase-1和GSDMD的表達(dá)增高，丁酸鈉可通過Caspase-1/GSDMD途徑抑制細(xì)胞焦亡和促炎性因子的釋放[23]。有研究報(bào)道，lncRNA可通過改變miRNA的表達(dá)來改善DN，lncRNA-GAS5過表達(dá)通過下調(diào)miR-452-5p的表達(dá)來抑制HG誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞焦亡[24]。結(jié)合既往研究結(jié)果，提示GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡可促進(jìn)高葡萄糖狀態(tài)下腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的損傷，但細(xì)胞焦亡在DN中的發(fā)生機(jī)制仍未完全闡明。

綜上，推測(cè)DM小鼠腎組織中可能發(fā)生活性Caspase-1介導(dǎo)關(guān)鍵蛋白GSDMD激活引起的細(xì)胞焦亡。本次研究為DN病細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制研究提供初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)，而細(xì)胞焦亡在DN實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的具體發(fā)生機(jī)制及調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索，對(duì)指導(dǎo)DN的防治具有一定意義。