江詩雨 汪 洋 周 莉 陳 帆 李 志 桂建芳

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院水生生物研究所種子創(chuàng)新研究院, 北京 100101; 3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)通路(Bone morphogenetic protein signaling, BMP signaling)在動(dòng)物生殖系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持的多個(gè)生命過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用, 包括原始生殖細(xì)胞特化、增殖和遷移, 配子發(fā)生、濾泡形成等[1]。其中, BMP15主要由卵母細(xì)胞分泌, 首先在人和小鼠中被克隆[2], 后被證實(shí)為脊椎動(dòng)物所特有[3], 在哺乳動(dòng)物的濾泡發(fā)育和閉鎖、產(chǎn)卵、繁殖力維持以及授精等過程中起著關(guān)鍵作用[4—10]。

關(guān)于魚類bmp15基因研究得較少, 近年來僅在斑馬魚(Danio rerio)[11]、歐洲鱸魚(Dicentrarchus labrax)[12,13]、銀鯽(Carassius gibelio)[14]、稀有鯽(Gobiocypris rarus)[15]、黃尾(Seriola lalandi)[16]、黑鯛(Acanthopagrus schlegelii)[17]、大西洋鮭(Salmo salarL.)[18]和胡鲇(Clarias batrachus)[19]中報(bào)道了bmp15的克隆和表達(dá)分析。對這些魚類bmp15基因的表達(dá)分析表明,bmp15基因不僅在成體組織的分布, 而且在不同發(fā)育階段性腺和胚胎中的表達(dá)譜式以及在卵巢中的定位都存在差異, 表現(xiàn)出物種的特異性。譬如, 在斑馬魚、歐洲鱸魚、銀鯽和稀有鯽中, 除了在卵巢中高表達(dá)和精巢中中等豐度的表達(dá)外, 在肝、腎、腦、垂體等多個(gè)組織中也有低豐度的表達(dá)[11,12,14,15]; 而大西洋鮭bmp15-like僅在性腺中表達(dá), 在其他組織中檢測不到[18]。不同于哺乳動(dòng)物和其他魚類bmp15的報(bào)道[2,12,14,15,20—22], 斑馬魚bmp15不僅在卵子中表達(dá), 還在顆粒細(xì)胞和鞘細(xì)胞中檢測到了mRNA和蛋白的存在[11]。

多倍化(Polyploidization)是指基因組中加入了一套或多套完整的染色體組。除了在脊椎動(dòng)物進(jìn)化歷程中均發(fā)生的兩輪全基因組復(fù)制外, 輻鰭魚類還發(fā)生了第3輪魚類特異的全基因組復(fù)制(Fish-specific genome duplication, Ts3R)[23—25]。在突破不穩(wěn)定的瓶頸后, 多倍體會(huì)通過隨后的二倍化進(jìn)化成一個(gè)新的二倍體。在“多倍化-二倍化”的進(jìn)化歷程中,多倍體通過重復(fù)基因的新功能化或亞功能化、基因組的重排、基因的表達(dá)變異、等位基因的特異沉默、表觀遺傳的重塑等創(chuàng)造了大量的進(jìn)化機(jī)會(huì),增加了等位基因的多樣性, 改變了基因組的復(fù)雜性,產(chǎn)生了新的性狀并驅(qū)動(dòng)改變生態(tài)位和擴(kuò)大地理分布[26—31]。多倍體銀鯽通常被視為鯽(Carassius auratusL.)的一個(gè)亞種(C. auratus gibelioBloch)[32], 但隨著對其核型、生殖方式、性別決定方式等研究的深入, 已逐漸被視為一個(gè)獨(dú)立的物種[33—40]。銀鯽擁有156條染色體或162條染色體[41], 由于其具有100條染色體的近緣種金魚已被證明發(fā)生了四倍化事件[42], 因此銀鯽應(yīng)為超三倍體或進(jìn)化的六倍體[43]。通過對銀鯽2個(gè)歧化的Dmrt1基因的序列和染色體定位分析揭示了銀鯽進(jìn)化歷程中發(fā)生了兩輪多倍化事件[44]。盡管已在銀鯽中鑒定了一個(gè)bmp15基因[14],但對銀鯽Dmrt1基因[44]、頭腎組織的轉(zhuǎn)錄組[45]以及干擾素系統(tǒng)基因的分析[46]均表明, 銀鯽是一個(gè)異源多倍體, 一個(gè)基因在其基因組中至少存在2個(gè)高度分化的等位基因。除了已鑒定的bmp15基因外, 銀鯽是否還存在其他bmp15等位基因, 它們在表達(dá)上是否發(fā)生了明顯歧化, 目前尚不清楚。因此, 本研究克隆鑒定了2個(gè)歧化的bmp15基因Cgbmp15a和Cgbmp15b的6個(gè)等位基因, 分析了它們的基因組結(jié)構(gòu)和與其鄰近基因的共線性關(guān)系, 以及Cgbmp15a和Cgbmp15b在成體組織、不同發(fā)育階段卵子和孕酮激素DHP誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟過程中的表達(dá)差異,為研究多倍體魚類重復(fù)基因的進(jìn)化和bmp15在魚類生殖調(diào)控中的作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用的銀鯽F系選自于中國科學(xué)院水生生物研究所官橋?qū)嶒?yàn)基地。繁殖季節(jié)隨機(jī)抽取3條性成熟的銀鯽F系, 取肝、脾、腎、腦、下丘腦、垂體和卵巢組織部分樣品; 并將卵巢置于盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中, 在顯微鏡下利用機(jī)械分離法獲得不同發(fā)育時(shí)期的卵細(xì)胞, 根據(jù)直徑大小進(jìn)行分類, 分為初級卵母細(xì)胞(0.06—0.13 mm, Ⅰ期)、皮質(zhì)泡期卵母細(xì)胞(0.21—0.23 mm, Ⅱ期)、卵黃形成期卵母細(xì)胞(0.30—0.33 mm,Ⅲ1期和0.45—0.48 mm, Ⅲ2期)、成熟卵母細(xì)胞(1.04—1.22 mm, Ⅳ期)。將各樣品放入無RNA酶的EP管中, 迅速經(jīng)液氮速凍后置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取和SMARTer cDNA模板合成

所用離心管、槍頭、溶液均無RNA酶, 玻璃器皿及金屬器械經(jīng)240℃高溫烘烤4h后使用。按照Trizol和SV Total RNA Isolation System試劑盒(Promega)說明書進(jìn)行各樣品總RNA的提取, 并分別用Nanodrop 2000C(Thermo Fisher Scientific, 美國)分光光度計(jì)和1.2%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度和完整性。用SMARTer RACE 5′/3′ Kit(Clontech,美國)合成了銀鯽F系卵巢組織3′ cDNA和5′ cDNA,具體參考Xie等[47]描述的方法。合成的cDNA置于-20℃保存。

1.3 銀鯽F系Cgbmp15a和Cgbmp15b cDNA全長克隆

以斑馬魚bmp15的基因組序列為搜索序列, 在銀鯽F系基因組中搜尋到了2個(gè)同源性較高的序列ENSDARP00000054590-C1和ENSDARP 00000054590-C2, 分別命名為Cgbmp15a和Cgbmp15b。參照這2個(gè)序列, 利用Primer Premier 5和Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)RACE內(nèi)外引物(表1)。以卵巢3′ cDNA和5′ cDNA為模板, 使用RACE外引物Cgbmp15a-5′-Outer、Cgbmp15b-5′-Outer、Cgbmp15a-3′-Outer、Cgbmp15b-3′-Outer與UPM分別進(jìn)行5′或3′第一次PCR, 電泳檢測首次PCR產(chǎn)物若無目的條帶, 將首次PCR產(chǎn)物稀釋100倍后為模板, 用相應(yīng)的RACE內(nèi)引物Cgbmp15a-5′-Inner、Cgbmp15b-5′-Inner、Cgbmp15a-3′-Inner、Cgbmp15b-3′-Inner和NUP進(jìn)行巢式PCR, 2次PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序均參見文獻(xiàn)[48]。目的條帶經(jīng)1.1%瓊脂糖凝膠電泳采用Gel Extraction Kit(Omega Bio-Tek, 美國)回收后, 產(chǎn)物連接pMD18-T載體(TaKaRa), 各選取20個(gè)陽性克隆由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行雙向測序, 序列經(jīng)拼接后, 得到Cgbmp15a和Cgbmp15b的cDNA全長序列。

1.4 銀鯽F系Cgbmp15a和Cgbmp15b基因序列分析與進(jìn)化分析

根據(jù)已獲得的Cgbmp15a和Cgbmp15b全長cDNA序列, 應(yīng)用DNAMAN預(yù)測開放閱讀框(ORF),推導(dǎo)其編碼的氨基酸序列, 并在Ensembl genome browser 92(http://asia.ensembl.org/index.html)和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下載多個(gè)物種的Bmp15氨基酸序列, 應(yīng)用BioEdit軟件進(jìn)行Bmp15多重序列比對分析。不同物種Bmp15氨基酸的登錄號(hào)如下: 銀鯽Carassius gibelioBmp15(ADW20149.1)、鯽Carassius auratusBmp15a-1(MH297584)、鯽Carassius auratusBmp15a-2(MH297583)、鯽Carassius auratusBmp15b(MH 297582)、斑馬魚Danio rerioBmp15(AAI24107.1)、稀有鯽Gobiocypris rarusBmp15 (AHK22790.1)、河鲀Takifugu rubripesBmp15(ENSTRUP000000 17355)、羅非魚Oreochromis niloticusBmp15(XP_003457772.1)、青鳉Oryzias latipesBmp15(XP_004079992.1)、雀鱔Lepisosteus oculatusBmp15(XP_006632858.2)、爪蟾Xenopus tropicalisBmp15(XP_002936834.2)、雞Gallus gallusBMP15(ENSGALP00000007547)、小鼠Mus musculusBMP15(AAH55363.1)和人Homo sapiensBMP15(EAW 89914.1)。

表1 本文中所用引物Tab. 1 Primers used in this study

以Cgbmp15a和Cgbmp15bcDNA序列為基礎(chǔ),在其ORF區(qū)域設(shè)計(jì)引物來進(jìn)行銀鯽F系BAC文庫篩選。篩選到的BAC序列目的片段經(jīng)測序驗(yàn)證后, 利用同源法注釋對BAC上的基因進(jìn)行預(yù)測, 進(jìn)行bmp15的基因組結(jié)構(gòu)和與其鄰近基因的同線性關(guān)系分析。用MEGA 6.06軟件, 采用最大似然法(ML法)對銀鯽bmp15、鯽bmp15和斑馬魚bmp15的基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.5 Cgbmp15a和 Cgbmp15b在銀鯽F系不同組織以及不同時(shí)期卵母細(xì)胞中的表達(dá)

選取樣品總RNA 0.1 μg, 利用GoldScript cDNA合成試劑盒(invitrongen, 上海)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,具體步驟參見文獻(xiàn)[49]。使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)Cgbmp15a和Cgbmp15b基因RT-qPCR特異性引物(表1)。選取異育銀鯽β-actin作為內(nèi)參基因, 用CFX96TMOptics Module(美國Bio-Rad公司)進(jìn)行熒光定量PCR, 反應(yīng)條件如下: 95℃預(yù)變性30s; 95℃變性5s, 60℃, 30s, 40cycles; 65℃, 5s; 95℃, 5s。進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù), 并每個(gè)樣品做3次技術(shù)性重復(fù),以β-actin作為內(nèi)參引物, 序列參見文獻(xiàn)[48], 用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對表達(dá)量, 采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)來表示。數(shù)據(jù)分別經(jīng)過正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后, 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行方差分析,P＜0.05表示存在顯著性差異, 柱形圖用Graph-Pad Prism 6進(jìn)行繪制。

1.6 Cgbmp15a和 Cgbmp15b在DHP體外誘導(dǎo)銀鯽F系卵母細(xì)胞成熟過程中的表達(dá)分析

在繁殖季節(jié)取性成熟的銀鯽F系雌性個(gè)體, 用鑷子將卵母細(xì)胞從卵巢中剝離出, 挑取處于生發(fā)泡1期(Germinal vesicle 1 stage, GV1期)卵母細(xì)胞, 轉(zhuǎn)移至預(yù)熱(21—23℃)的卵母細(xì)胞培養(yǎng)液格氏平衡鹽溶液(Gey’s balanced salt solution, GBSS, 7.25 g NaCl, 0.41 g NaH2PO4, 0.38 g KCl, 0.95 g HEPES,1.0 g葡萄糖, pH8.5, 0.147 g CaCl2, 0.23 g MgSO4,0.1 g 1000 U青霉素, 0.1 g硫酸鏈霉素, 配制1 L)中培養(yǎng)。再向培養(yǎng)液中加入孕酮激素(17α, 20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one, DHP, 終濃度為1 μg/mL),每毫升培養(yǎng)液培養(yǎng)10顆卵母細(xì)胞, 23℃培養(yǎng)誘導(dǎo)卵母細(xì)胞體外成熟[50]。每隔2h取樣1次, 每次取30顆卵, 利用Trizol和SV Total RNA Isolation System試劑盒說明書進(jìn)行各樣品總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄cDNA以及qRT-PCR檢測Cgbmp15a和Cgbmp15b基因的表達(dá)。擴(kuò)增條件和數(shù)據(jù)分析同上。

2 結(jié)果

2.1 銀鯽F系Cgbmp15a和Cgbmp15b的3個(gè)不同等 位基因的分子特征

根據(jù)銀鯽F系基因組中2個(gè)與斑馬魚bmp15基因的同源序列設(shè)計(jì)特異引物, 通過RACE-PCR各獲得了Cgbmp15a和Cgbmp15b的3個(gè)全長cDNA序列。其中Cgbmp15a的3個(gè)全長cDNA大小分別為2133、2147和2143 bp, 它們之間的平均一致性為(98.73±0.35)%; 它們的開放閱讀框(ORF)均為1128 bp,編碼375個(gè)氨基酸, 平均一致性為(99.29±0.13)%, 它們在第152、第157、第164和第286位氨基酸存在差異(圖1)。而Cgbmp15b的3個(gè)全長cDNA存在較大的差異, 大小分別為2030、1824和1648 bp, 它們之間的一致性為(84.88±4.40)%, 差異主要在3′端;它們的開放閱讀框均為1143 bp, 編碼380個(gè)氨基酸,平均一致性為(99.3±0.33)%, 在第167、第203、第268和第359位氨基酸存在差異(圖1)。Cgbmp15a和Cgbmp15b之間cDNA的一致性為(73.85±6.25)%,氨基酸的一致性為(87.36±0.17)%。

不同物種Bmp15蛋白序列比對結(jié)果顯示, 本研究克隆的CgBmp15a和CgBmp15b與已報(bào)道的銀鯽Bmp15[14]的一致性分別為(92.13±0.12)%和(94.20±0.12)%, 表明已報(bào)道的銀鯽Bmp15跟CgBmp15b同源性更高。同時(shí)我們在四倍體鯽基因組中搜索到3個(gè)bmp15等位基因, 分別命名為Cabmp15a-1、Cabmp15a-2和Cabmp15b; 在斑馬魚、稀有鯽、河鲀、羅非魚、青鳉和雀鱔等其他魚類基因組中,均只搜索到一個(gè)bmp15基因。CgBmp15a和CgB-mp15b與其他魚類Bmp15的平均一致性分別在35.50%—80.52%和36.55%—81.82%, 而與人、小鼠、雞和爪蟾Bmp15的一致性在28.27%—41.52%和29.30%—32.48%。

圖1 銀鯽Cgbmp15a和Cgbmp15b的3個(gè)等位基因的基因組結(jié)構(gòu)Fig. 1 Schematic diagram for gene structure of gibel carp Cgbmp15as and Cgbmp15bs

2.2 銀鯽F系Cgbmp15a和Cgbmp15b的不同等位基因的基因組結(jié)構(gòu)和相鄰基因共線性分析

我們將所克隆到的6個(gè)銀鯽bmp15等位基因序列在銀鯽F系的BAC文庫中進(jìn)行篩選, 并將篩選到的BAC克隆的全序列與6個(gè)cDNA序列進(jìn)行比對, 分別獲得6個(gè)含銀鯽bmp15 cDNA序列的BAC克隆。Cgbmp15a的3個(gè)BAC克隆的大小分別為122.75、145.62和106.83 kb,Cgbmp15b的3個(gè)BAC克隆的大小分別為90.06、151.96和35.05 kb。我們對6個(gè)BAC克隆上的基因進(jìn)行了預(yù)測, 并分析了銀鯽6個(gè)bmp15等位基因的基因組結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果表明,Cgbmp15a和Cgbmp15b的3個(gè)不同等位基因具有相同的基因組結(jié)構(gòu), 均由兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子組成(圖1)。Cgbmp15a的3個(gè)等位基因的兩個(gè)外顯子長度均分別為315和810 bp, 內(nèi)含子大小為398 bp;Cgbmp15b的3個(gè)等位基因的2個(gè)外顯子長度均分別為333和807 bp, 內(nèi)含子為416 bp; 通過SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)軟件分析表明這6個(gè)Bmp15蛋白都含有一個(gè)保守的TGF-β結(jié)構(gòu)域, 且N端都含有一個(gè)信號(hào)肽。其中CgBmp15a的信號(hào)肽處于N端1—32位, TGF-β結(jié)構(gòu)域位于第274—375位氨基酸; 而CgBmp15b的信號(hào)肽處于N端1—28位,TGF-β結(jié)構(gòu)域位于第279—380位氨基酸。

接著, 我們比較了6個(gè)BAC克隆上與其他鄰近基因的同線性關(guān)系(圖2)。Cgbmp15a-1-BAC、Cgbmp15a-2-BAC和Cgbmp15a-3-BAC均含有NHS-like2(nhsl2)、ribosomal protein S4、X-linked(rps4x)、histone deacetylase8(hdac8)、liver-expressed antimicrobial peptide2(leap2)、bmp15、glutamic-oxaloacetic transaminase2b(got2b)、solute carrier family38、member7(slc38a7)基因, 且具有保守的共線性關(guān)系。由于Cgbmp15a-2-BAC比Cgbmp15a-1-BAC和Cgbmp15a-3-BAC分別長22.87和38.79 kb,因此還包含lysosomal protective protein-like(lppl)、cytochrome P450,family2、subfamily X、polypeptide10.2(cyp2x10.2)、3A1-like、pollen-specific leucine-rich repeat extensin-like protein2 (pslr relp2)基因。而Cgbmp15b的3個(gè)BAC克隆序列長度和包含的序列差異較大, 除了bmp15基因外, 還均含有g(shù)ot2b基因。與Cgbmp15b-1-BAC和Cgbmp15b-3-BAC相比,Cgbmp15b-2-BAC缺失了slc38a7基因。與Cgbmp15a的3個(gè)BAC序列相比,Cgbmp15b-2-BAC的bmp15上游還存在Tc1-like基因, 但缺失了nhsl2、leap2和slc38a7基因; 而Cgbmp15b-1-BAC的bmp15下游還包含3A1-like基因, 但缺失了lppl和cyp2x10.2基因。同時(shí), 我們在Ensembl數(shù)據(jù)庫獲得了人、小鼠、雞、斑馬魚、青鳉和河鲀的bmp15基因所在區(qū)域的基因組序列, 與銀鯽bmp15基因所在區(qū)域進(jìn)行同線性分析。結(jié)果表明, 斑馬魚bmp15基因及其8個(gè)鄰近基因與銀鯽Cgbmp15a和鄰近基因的同線性關(guān)系保守性最強(qiáng), 僅在bmp15下游缺失了lppl和pslrrelp2基因。而其他脊椎動(dòng)物bmp15基因下游未預(yù)測到與銀鯽Cgbmp15a的相同下游基因。與銀鯽Cgbmp15a-BAC、斑馬魚和青鳉相比, 人、小鼠、雞和河鲀bmp15基因上游還缺失了leap2基因。

為了揭示銀鯽6個(gè)bmp15等位基因的進(jìn)化關(guān)系和起源, 我們以斑馬魚bmp15、3個(gè)鯽bmp15等位基因、6個(gè)銀鯽bmp15等位基因的基因組全序列, 采用最大似然法(ML法)構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。從圖中我們可以看出, 斑馬魚Drbmp15作為外群, 銀鯽Cgbmp15a的3個(gè)等位基因與鯽的Cabmp15a的2個(gè)等位基因聚為一簇, 銀鯽Cgbmp15b的3個(gè)等位基因與鯽的Cabmp15b聚為另一簇, 而不是同一物種bmp15的不同等位基因聚在一起。由此我們推測銀鯽和鯽擁有共同的原始祖先, 并且在圖3中標(biāo)注出了在祖先家系中基因/基因組復(fù)制事件。

圖2 銀鯽Cgbmp15a和Cgbmp15b基因與其鄰近基因保守的共線性關(guān)系(數(shù)據(jù)來自Ensemble數(shù)據(jù)庫)Fig. 2 Schematic diagram for bmp15 and context genes of gibel carp Cgbmp15a and Cgbmp15b BACs and the bmp15 homologs of other species from Ensemble database

2.3 銀鯽F系Cgbmp15a和Cgbmp15b在卵巢中高豐度表達(dá)

由于Cgbmp15a和Cgbmp15b的3個(gè)不同等位基因之間的一致性非常高, 因此我們針對Cgbmp15a和Cgbmp15b之間的序列差異, 設(shè)計(jì)2對特異引物,采用RT-qPCR方法檢測Cgbmp15a和Cgbmp15b在銀鯽F系成體組織中的分布。結(jié)果表明, 銀鯽F系Cgbmp15a和Cgbmp15b均在卵巢中高表達(dá), 并且Cgbmp15a的表達(dá)水平顯著高于Cgbmp15b(P＜0.05)。Cgbmp15b在垂體中可檢測到微量轉(zhuǎn)錄本的存在,而在肝、脾、腎、腦和下丘腦中檢測不到轉(zhuǎn)錄本的存在。與Cgbmp15b不同的是, 除了在垂體中外,Cgbmp15a還可以在肝、腦和下丘腦中檢測到低豐度轉(zhuǎn)錄本的存在(圖4)。

2.4 銀鯽F系Cgbmp15a和Cgbmp15b隨著DHP體外誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟上調(diào)表達(dá)水平

由于Cgbmp15a和Cgbmp15b在銀鯽卵巢中高表達(dá), 隨后我們分析了它們在不同發(fā)育階段卵母細(xì)胞中的表達(dá)水平差異。結(jié)果表明, 隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟,Cgbmp15a和Cgbmp15b表達(dá)水平均呈先升高再降低的趨勢; 在皮質(zhì)泡期卵母細(xì)胞中表達(dá)量達(dá)到最高, 隨后降低; 且在初級卵母細(xì)胞到卵黃形成期卵母細(xì)胞中,Cgbmp15a的表達(dá)量始終顯著高于同時(shí)期Cgbmp15b的表達(dá)量(P＜0.05); 在成熟卵母細(xì)胞中二者無顯著性差異(圖5A)。

接著, 我們采用DHP體外誘導(dǎo)銀鯽F系GV1期卵母細(xì)胞成熟, 并分析了Cgbmp15a和Cgbmp15b在誘導(dǎo)成熟過程中的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明,Cgbmp15a在誘導(dǎo)6h后開始上調(diào)表達(dá), 在誘導(dǎo)8h后達(dá)到最高表達(dá)水平, 隨后下降。而Cgbmp15b在誘導(dǎo)8h后表達(dá)水平有微弱上調(diào), 隨后下降。在誘導(dǎo)后6—12h,Cgbmp15a表達(dá)量均顯著高于同時(shí)期Cgbmp15b的表達(dá)量(P＜0.05, 圖5B)。

圖3 ML法構(gòu)建的銀鯽、鯽和斑馬魚bmp15基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 The phylogenetic tree of gibel carp, crucian carp, and zebrafish bmp15 based on ML method

圖4 Cgbmp15a和Cgbmp15b mRNA在銀鯽不同成體組織中的表達(dá)分析Fig. 4 Relative expression of Cgbmp15a and Cgbmp15b in different adult tissues

圖5 不同發(fā)育階段卵母細(xì)胞(A)以及DHP體外誘導(dǎo)GV1期卵母細(xì)胞成熟過程(B)中Cgbmp15a和Cgbmp15b的表達(dá)分析Fig. 5 Expression of Cgbmp15a and Cgbmp15b in oocytes during oogenesis (A) and GV1 oocytes induced by DHP in vitro (B)

3 討論

在本研究中, 我們首先從銀鯽F系中克隆了2個(gè)歧化的bmp15基因Cgbmp15a和Cgbmp15b, 它們各自具有一致性較高的3個(gè)不同等位基因。在魚類的進(jìn)化歷程中, 除大部分魚類共同經(jīng)歷的Ts3R外[23—25],多倍化是一個(gè)重要且頻繁發(fā)生的現(xiàn)象。多倍化根據(jù)染色體組的來源差異分為同源多倍化和異源多倍化, 其中, 異源多倍體通過種內(nèi)或種間雜交產(chǎn)生。對鯉全基因組序列的解析表明在820萬年前發(fā)生了一次全基因組復(fù)制, 形成了異源四倍體[51]。對銀鯽2個(gè)歧化的Dmrt1基因的序列分析表明, 銀鯽在額外兩輪多倍化歷程中, 經(jīng)過大約1849萬年前的一次早期多倍化事件, 形成了銀鯽、鯽和鯉的四倍體共同祖先; 而第二輪多倍化則發(fā)生在大約51萬年前, 在鯽這一分支上形成了六倍體銀鯽[44]。本研究克隆鑒定的6個(gè)銀鯽F系bmp15不同等位基因的序列比對表明, 銀鯽是一個(gè)異源六倍體。接著, 我們搜索了四倍體鯽以及人、小鼠、雞、爪蟾、雀鱔、斑馬魚、稀有鯽、青鳉、羅非魚和河鲀的基因組中的bmp15基因, 結(jié)果表明, 在鯽基因組中有3個(gè)bmp15等位基因, 而在其他物種的基因組中, 均只搜索到一個(gè)bmp15基因。系統(tǒng)進(jìn)化樹和bmp15相鄰基因的同線性分析均表明(圖2和圖3), 在銀鯽的進(jìn)化歷程中發(fā)生了兩輪多倍化, 其中早期的異源多倍化整合了來自2個(gè)原始祖先的染色體組, 導(dǎo)致銀鯽和鯽的四倍體共同原始祖先基因組中包含bmp15a和bmp15b; 隨后第二輪同源多倍化最終導(dǎo)致銀鯽存在6個(gè)bmp15等位基因。

由于染色體不平衡和基因組的不穩(wěn)定, 新形成的異源多倍體會(huì)發(fā)生復(fù)雜的、非孟德爾遺傳方式的基因組變化, 包括染色體重排[52,53]、不同來源的2個(gè)部分同源基因(Homeologs)的缺失和沉默[54—59]、偏性或顯性表達(dá)[59—61]等。相對于Cgbmp15a的3個(gè)BAC克隆上的鄰近基因的分布,Cgbmp15b的3個(gè)BAC克隆基因均缺失了leap2基因, 并且Cgbmp15b-2-BAC還缺失了nhsl2和slc38a7基因,Cgbmp15b-1-BAC還缺失了lppl和cyp2x10.2基因(圖2)。同時(shí), 盡管在成體組織分布、不同發(fā)育階段卵子及孕酮激素DHP誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟過程中,Cgbmp15a和Cgbmp15b具有相似的表達(dá)譜式, 但Cgbmp15a的表達(dá)水平均顯著高于Cgbmp15b的表達(dá)水平(圖4和圖5)。這表明銀鯽在形成異源多倍體后, 其基因組在隨后的二倍化過程中發(fā)生了復(fù)雜的變化, 包括不同來源的2個(gè)部分同源基因的缺失或偏性表達(dá)。

與其他物種bmp15在成體組織中的分布相同,銀鯽Cgbmp15a和Cgbmp15b均在卵巢中檢測到了高豐度的轉(zhuǎn)錄本, 同時(shí)Cgbmp15a也在肝臟、腦、下丘腦和垂體等組織中檢測到低豐度的mRNA存在。在不同魚類中,bmp15基因在卵子發(fā)生的不同階段表達(dá)水平的變化是不同的。譬如,bmp15在斑馬魚不同發(fā)育階段的卵母細(xì)胞中均有表達(dá), 且表達(dá)水平無顯著性差異[11]。在歐洲海鱸中,bmp15在初級卵母細(xì)胞中高表達(dá), 從卵黃生成時(shí)期開始顯著降低[12]。在黑鯛中,bmp15在早期卵母細(xì)胞中高表達(dá),隨著卵母細(xì)胞的生長, 表達(dá)水平下降, 在卵黃發(fā)生的卵母細(xì)胞中基本檢測不到轉(zhuǎn)錄本的存在[17];bmp15在銀鯽Ⅰ期卵母細(xì)胞(0.025—0.062 mm)中表達(dá)水平最高, 在Ⅱ-Ⅳ期卵母細(xì)胞中維持著相對低豐度、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄本含量[14]。研究結(jié)果與已報(bào)道的銀鯽bmp15不同,Cgbmp15a和Cgbmp15b在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中高表達(dá)于皮質(zhì)泡期卵母細(xì)胞中(0.21—0.23 mm, 圖5A)。通過比較卵母細(xì)胞分期的直徑大小, 我們推測導(dǎo)致這種不同結(jié)果的原因可能是由于取材分析的銀鯽卵巢處于不同發(fā)育階段,或者銀鯽克隆系的不同。與人絨毛膜促性腺激素(hCG)體外誘導(dǎo)銀鯽卵母細(xì)胞成熟過程中, 銀鯽bmp15上調(diào)表達(dá)結(jié)果相同[14], 當(dāng)我們采用DHP體外誘導(dǎo)銀鯽F系GV1期卵母細(xì)胞成熟時(shí),Cgbmp15a在誘導(dǎo)6h后開始上調(diào)表達(dá)水平, 在誘導(dǎo)8h后達(dá)到最高表達(dá)水平, 隨后下降。而Cgbmp15b變化較小(圖5B)。前期的研究表明, 銀鯽GV1卵母細(xì)胞在DHP體外誘導(dǎo)4.5h后, 生發(fā)泡開始破裂; 誘導(dǎo)8h后, 超過90%的卵母細(xì)胞的生發(fā)泡均破裂[50]。結(jié)合Cgbmp15a和Cgbmp15b在成體組織及不同發(fā)育階段卵子中的表達(dá)差異(圖4和圖5A), 我們推測Cgbmp15a在銀鯽的卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟中起著主要作用。Cgbmp15a和Cgbmp15b在銀鯽生殖中的功能歧化有待進(jìn)一步的研究。