羅燕兒 趙 慧 郭道遠(yuǎn), 王 歡 陳孝煊, 吳志新

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 武漢 430070; 2. 湖北省水生動物病害防控工程技術(shù)研究中心, 武漢 430070; 3. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實驗室, 武漢 430070; 4. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖國家級實驗教學(xué)示范中心, 武漢 430070)

草魚(Ctenopharyngodon idella)是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一[1,2], 隨著集約化養(yǎng)殖的發(fā)展, 脂肪肝在養(yǎng)殖草魚中發(fā)病率不斷上升, 已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)關(guān)注的嚴(yán)重問題[3]?！岸未驌簟睂W(xué)說在脂肪肝病的發(fā)病機制中受到認(rèn)可并得到深入研究, 學(xué)說表明氧化應(yīng)激在脂肪肝病發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中起重要作用[4]。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)廣泛存在于養(yǎng)殖水體中, 是淡水魚類養(yǎng)殖過程中的主要致病菌。本實驗室研究表明, 感染嗜水氣單胞菌可降低草魚抗氧化能力, 誘發(fā)肝臟脂質(zhì)過氧化[5]和肝臟脂質(zhì)沉積[6]。研究表明, 益生菌可顯著減輕哺乳動物肝臟脂肪肝等癥狀, 改善肝功能[7,8]。益生枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖, 可調(diào)節(jié)水質(zhì)[9]、增強水產(chǎn)動物的免疫力和抗氧化能力[5,10]、調(diào)節(jié)腸道菌群及增強消化酶活性[11,12]等,但對其在魚類肝臟脂質(zhì)代謝方面研究甚少。

因此, 本研究分別在感染嗜水氣單胞菌前后投喂含益生枯草芽孢桿菌的飼料, 探究枯草芽孢桿菌對肝臟脂質(zhì)代謝的作用及可能機制, 為益生菌在草魚“保肝護(hù)肝”方面的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

實驗用嗜水氣單胞菌Ah1菌株分離自細(xì)菌敗血癥銀鯽; 枯草芽孢桿菌Ch9菌株分離自草魚腸道。以上菌株均有由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院水產(chǎn)動物醫(yī)學(xué)實驗室提供和保存。

1.2 實驗飼料

本實驗兩種飼料配方及營養(yǎng)成分實測值見表1,飼料原料購自湖北海大飼料有限公司。飼料原料經(jīng)粉碎后過60目篩, 制作含枯草芽孢桿菌的飼料時將枯草芽孢桿菌菌液代替無菌水, 所有原料混合均勻后經(jīng)小型制粒機加工成直徑為2.0 mm的顆粒飼料, 風(fēng)干后置于-20℃冰箱中保存。采用平板計數(shù)法測定飼料中枯草芽孢桿菌的含量約為1×107CFU/g。

表1 實驗飼料配方及基本成分Tab. 1 Compositions of experimental diets

1.3 實驗設(shè)計

實驗用草魚購自湖北省黃岡市團(tuán)風(fēng)縣百容水產(chǎn)良種有限公司。暫養(yǎng)4周后選取外觀健康、規(guī)格一致的草魚(50.53±0.70) g隨機分配到12個容量為300 L的養(yǎng)殖缸(一共4個組, 每組3個重復(fù)), 每個缸投放密度為25尾。

實驗分為4個組, 具體分組情況如表2所示, 實驗開始時對照組每尾魚腹腔注射0.1 mL 0.01mol/L滅菌PBS, 其余各組每尾魚腹腔注射0.1 mL 1.0×106CFU/mL 嗜水氣單胞菌菌液。嗜水氣單胞菌的濃度為LC50的10%(半致死濃度為1×106CFU/fish)。實驗用魚均在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院養(yǎng)殖實驗基地進(jìn)行循環(huán)水養(yǎng)殖, 整個實驗期間水質(zhì)條件: 水溫(25±1)℃、pH 7.5±0.3、溶解氧(7±0.45) mg/L、氨氮含量(0.015±0.002) mg/L以及亞硝酸鹽氮(0.05±0.008) mg/L, 光周期為自然光周期。養(yǎng)殖實驗持續(xù)56d, 每天飽食投喂飼料2次(8:30和16:30), 未吃完的剩余飼料在投喂之后的2h使用虹吸管收集, 并將其在烘箱中以60℃干燥12h至恒重, 以確定各組實驗魚的實際攝食量。

1.4 樣品采集

分別在感染嗜水氣單胞菌后的第28和第56天,將草魚饑餓24h。用MS-222(10 mg/L)麻醉后, 將每缸魚計數(shù)并稱重。每組隨機選擇24尾魚, 其中6尾魚測量個體的體長、體重、內(nèi)臟重量和肝臟重量,及從尾靜脈取血以獲得血清; 6尾魚用于總RNA提取及抗氧化酶的測定; 6尾魚用于肝臟脂質(zhì)含量的測定; 6尾魚取得的肝臟放入多聚甲醛固定液固定以備后續(xù)冰凍切片。

1.5 樣品分析

脂肪含量的測定及油紅染色分析脂肪含量的測定: 將肝臟樣品在-50℃冷凍干燥24h, 然后用索氏抽提法測定肝臟的粗脂肪含量。

油紅O染色分析: 用于油紅O染色的肝臟樣本用多聚甲醛固定48h后, 進(jìn)行脫水、包埋、切片(厚度8 μm)、染色和拍照。從每個樣本中隨機選取10個視野, 用Image-Pro Plus 6.0軟件計算肝組織中染成紅色的脂滴的相對面積, 采用雙盲法統(tǒng)計各圖,匯總得到結(jié)果。

表2 實驗分組設(shè)計Tab. 2 The experimental design

血清生化指標(biāo)測定血清膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量以及血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性采用荷蘭威圖全自動生化分析儀測定, 試劑盒均購自中生北控生物科技股份有限公司。

脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)分析從草魚肝臟中提取RNA, 然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 以β-肌動蛋白(βactin)為內(nèi)參, 使用Roche Light Cycler 480 real-time PCR儀進(jìn)行實時熒光定量PCR, 引物見表3(由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成)。反應(yīng)總體系為20 μL, 包括cDNA 2 μL、上下游引物各0.5 μL、焦碳酸二乙酯(Diethylpyrocarbonate, DEPC)水7 μL、2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL(Aidlab, PC5902)。

抗氧化指標(biāo)測定取得的肝臟樣品在冰上解凍后, 制成勻漿液, 用于測定總抗氧化能力(TAOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、氧化氫酶(CAT)、還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2), 以上指標(biāo)均按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測,試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

生長性能及形體指標(biāo)數(shù)據(jù)計算成活率(Survival rate,SR, %)=100×(終尾數(shù)/初尾數(shù))

體增重率(Weight gain rate,WGR, %)=100×(末體重-初體重)/初體重

特定生長率(Special growth rate,SGR, %/d)=100×(Ln末體重-Ln初體重)/飼養(yǎng)天數(shù)

攝食量(Feed intake,FI, g/fish)=飼料消耗量(g,干重)/魚數(shù)量

飼料系數(shù)(Feed conversion rate,FCR)=每缸投喂飼料總量/每缸魚體總增重量

肥滿度(Condition factor,CF, g/cm3)=100×體重(g)/[體長(cm)]3

肝胰臟指數(shù)(Hepatosomatic index,HSI, %)=100×肝重(g)/體重(g)

內(nèi)臟指數(shù)(Viscera index,VSI, %)=100×內(nèi)臟重(g)/體重(g)

表3 RT-PCR引物序列Tab. 3 Primers used for real-time PCR

1.6 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示,采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行處理, 相同取樣天數(shù)的不同分組采用單因素方差分析, 差異顯著時通過Duncan’s檢驗方法進(jìn)行多重比較, 以P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。比較同一分組的兩個取樣時間點之間的顯著性采用獨立樣本T檢驗, 以P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 枯草芽孢桿菌對草魚生長性能、攝食量及形態(tài)學(xué)參數(shù)的影響

如表4所示, Ah+Bs組及Bs+Ah組WGR、SGR于第28d和第56天時, 均顯著高于Ah組(P＜0.05), 并于第56天時顯著高于對照組(P＜0.05), 且Ah+Bs組FCR顯著低于Ah組(P＜0.05)。在兩個取樣時間點,CF、HSI和VSI在各組之間無顯著差異(P＞0.05,表5)。

2.2 枯草芽孢桿菌對草魚肝臟脂肪含量的影響

經(jīng)染色后, 脂質(zhì)呈紅色, 細(xì)胞核呈藍(lán)色。圖1中油紅O染色結(jié)果(A-H)及對油紅O染色的脂滴所占相對面積統(tǒng)計結(jié)果(圖1-I)顯示, 28d時油紅O染色的脂滴面積在Ah組顯著增加(P＜0.05), 而在Bs+Ah組及Ah+Bs組變化無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);第56天時各組脂滴面積無顯著差異(P＞0.05)。圖1-J為肝臟脂肪含量測定結(jié)果: 第28天時, Ah組的脂肪含量顯著高于對照組(P＜0.05), Ah+Bs和Bs+Ah組脂肪含量與Ah組相比顯著降低(P＜0.05)。第56天時, 各組肝臟脂肪含量均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。對照組、Bs+Ah組及Ah+Bs組在第56天時的肝臟脂肪含量顯著高于第28天時的脂肪含量(P＜0.05)。

表4 益生枯草芽孢桿菌對草魚生長性能及攝食量的影響Tab. 4 Effects of B. subtilis on growth performance and food intake of grass carps

表5 益生枯草芽孢桿菌對草魚形態(tài)學(xué)參數(shù)的影響Tab. 5 Effects of B. subtilis on morphological parameters of grass carps

2.3 枯草芽孢桿菌對草魚血清生化指標(biāo)的影響

如表6所示, 第28天時, TG和HDL-C含量在Ah+Bs組較Ah組有升高的趨勢, 在Bs+Ah組顯著高于Ah組(P＜0.05); AST活性在Ah+Bs組較Ah組顯著降低(P＜0.05); 此外, TG、HDL-C含量及AST活性在Ah+Bs及Bs+Ah組與對照組均無顯著差異(P＞0.05)。第56天時, CHO、HDL-C和LDL-C含量在Bs+Ah組較Ah組顯著升高(P＜0.05), 在Ah+Bs組有升高的趨勢, 且均與對照組無顯著差異(P＞0.05)。AST和ALT活性在Ah組顯著高于對照組(P＜0.05),而在Ah+Bs和Bs+Ah組則與對照組無顯著差異(P＞0.05)。

2.4 枯草芽孢桿菌對草魚肝臟脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖2所示, 第28天時, Ah組ACCα表達(dá)水平較對照組顯著上調(diào)(P＜0.05),LPL、ATGL、SREBP-1c、PPARγ表達(dá)水平顯著下調(diào)(P＜0.05), 但這些基因表達(dá)水平在Ah+Bs及Bs+Ah組較對照組無顯著差異(P＞0.05)。PPARα表達(dá)水平在Ah+Bs和Bs+Ah組均較Ah組顯著上調(diào)(P＜0.05)且與對照組比無顯著差異(P＞0.05)。第56天時,FAS、ACCα、CPTIα1a、HSL、SPEBP-1c、PPARγ、PPARα的表達(dá)水平在Ah組顯著下調(diào)(P＜0.05), 但在Ah+Bs和Bs+Ah組較Ah組顯著上調(diào)或有上調(diào)的趨勢。與對照組比,ATGL表達(dá)水平在Ah組有下調(diào)的趨勢; 但在Ah+Bs組和Bs+Ah組較Ah組顯著上調(diào)(P＜0.05)。

2.5 枯草芽孢桿菌對草魚肝臟抗氧化能力的影響

如圖3所示, 第28天時CAT、SOD活性及第56天時T-AOC, 在Ah組較對照組顯著降低(P＜0.05), 在Ah+Bs組和Bs+Ah組較Ah組顯著升高(P＜0.05)。第28天時, GSH含量在Bs+Ah組較Ah組顯著升高(P＜0.05); H2O2含量在Ah組顯著升高(P＜0.05), 在Bs+Ah組顯著低于Ah組(P＜0.05)。Ah組MDA含量在兩個取樣時間點均顯著高于對照組(P＜0.05), 在Ah+Bs組和Bs+Ah組與對照組無顯著差異(P＞0.05)。

3 討論

3.1 枯草芽孢桿菌對草魚生長性能及形態(tài)學(xué)參數(shù)的影響

本研究表明, 感染嗜水氣單胞菌28d后, 草魚WGR、SGR有下降的趨勢,FCR有增加的趨勢。非洲鯰(Clarias gariepinus)在感染嗜水氣單胞菌后, 其SGR顯著下降,FCR顯著增加[13], 與本研究結(jié)果一致。本研究投喂益生菌飼料的草魚表現(xiàn)出更好的生長性能, 且在第56天時Ah+Bs組的FCR最小, 表明在飼料中添加枯草芽孢桿菌Ch9能促進(jìn)草魚生長,提高飼料的效率。在點帶石斑魚(Epinephelus coioides)[14]、里海鱒(Salmo caspius)[15]等魚類也有類似的報道。這可能是與芽孢桿菌能夠提高消化酶活性以及能產(chǎn)生酶, 減少抗?fàn)I養(yǎng)因子, 提高動物對營養(yǎng)的利用等有關(guān)[11,16,17]。

圖1 益生枯草芽孢桿菌對草魚肝臟脂質(zhì)沉積的影響Fig. 1 The effect of B. subtilis on hepatic lipid content in grass carp

表6 益生枯草芽孢桿菌對草魚血液生化參數(shù)的影響Tab. 6 Effects of B. subtilis on blood biochemical parameters of grass carps

3.2 枯草芽孢桿菌對草魚肝臟脂肪含量的影響

肝臟的脂肪含量及油紅染色結(jié)果表明, 嗜水氣單胞菌能夠造成草魚肝臟的脂質(zhì)積累, 而通過飼料中添加枯草芽孢桿菌可以改善這種狀況, 減少脂質(zhì)在草魚肝臟中的積累。具體體現(xiàn)為第28天時, Ah+Bs和Bs+Ah組草魚肝臟脂肪含量顯著低于Ah組, 且與對照組肝臟脂肪含量處于同一水平。在哺乳動物中, 已經(jīng)有許多文獻(xiàn)表明一些益生菌能減少肝臟中脂質(zhì)的積累, 治療脂肪肝病[18—20]。在魚類中,Shewanella屬的兩個益生菌菌株(Pdp11及Pdp13)及鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)在降低肝臟脂質(zhì)方面也有很大潛力[21—24]。

3.3 枯草芽孢桿菌對草魚血清生化指標(biāo)的影響

肝臟在脂質(zhì)代謝過程中具有許多作用(如攝取、轉(zhuǎn)運、合成及分解等), 進(jìn)入肝臟的脂肪酸, 能酯化成為TGs, 并能以脂滴的形式儲存在肝細(xì)胞中,或者以富含TGs的脂蛋白的形式分泌到血液中[25];當(dāng)肝細(xì)胞受到一定的損害時, 脂類代謝的平衡會被打破, 并影響血清中的血脂水平[26]。因此, 血脂水平等血清生化指標(biāo)可以在一定程度上反映出肝臟的健康狀態(tài)和機體脂質(zhì)代謝等狀況。本研究血清生化指標(biāo)結(jié)果顯示, 在注射嗜水氣單胞菌后第28天,TG顯著降低, 至第56天時CHO和LDL-C顯著降低,HDL-C也有降低的趨勢; 而投喂枯草芽孢桿菌飼料, 均能使血脂恢復(fù)到與對照組相同的水平。另外,在添加枯草芽孢桿菌后, 血清中AST和ALT活性較Ah組顯著下降, 表明枯草芽孢桿菌Ch9可能減少了嗜水氣單胞菌對肝臟的損害。已有研究表明, 鼠李糖乳桿菌、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)能降低羅非魚血清中AST和ALT的活性[27]。對尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)飼喂含有枯草芽孢桿菌的飼料, 血清中AST和ALT活性顯著下降[28]。因此,枯草芽孢桿菌在減少因嗜水氣單胞菌的感染對肝臟的損傷及其對脂質(zhì)代謝的影響, 改善因嗜水氣單胞菌感染造成的血脂下降方面具有一定潛力。

圖2 益生枯草芽孢桿菌對草魚肝臟脂代謝基因表達(dá)的影響Fig. 2 Effects of B. subtilis on mRNA levels of lipid metabolism genes of grass carp

圖3 益生枯草芽孢桿菌對草魚肝臟抗氧化酶活性及MDA和H2O2含量的影響Fig. 3 Effects of B. subtilis on activities of antioxidant enzymes and content of MDA and H2O2 in grass carp

3.4 枯草芽孢桿菌對草魚肝臟脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

為分析感染嗜水氣單胞菌及投喂枯草芽孢桿菌飼料對草魚肝臟脂肪合成、分解與調(diào)控相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響, 采用qPCR技術(shù)檢測草魚肝臟脂代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平。重要的脂肪生成相關(guān)酶, 如FAS、ACC, 以及重要的轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c和PPARγ可以促進(jìn)肝臟脂質(zhì)的合成;PPARα可誘導(dǎo)CPTI表達(dá), 促進(jìn)脂肪酸分解;HSL、ATGL、LPL均參與脂肪的水解[29—36],FAT/CD36除了與脂肪酸轉(zhuǎn)運相關(guān), 還在脂肪酸氧化代謝過程中發(fā)揮了重要作用[37—39]。本研究表明, 投喂枯草芽孢桿菌在維持肝臟正常脂質(zhì)代謝方面具有一定作用。第28天時Ah組ACCα較對照組顯著地上調(diào),LPL、ATGL、FAT/CD36顯著地下調(diào), 血清TG在第28天顯著降低, 表明感染嗜水氣單胞菌誘導(dǎo)草魚脂質(zhì)合成增加、脂質(zhì)分解及輸出減少, 導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)積累; 在投喂枯草芽孢桿菌后,ACCα的mRNA表達(dá)水平較Ah組下調(diào), 甘油三酯水解相關(guān)酶LPL及ATGLmRNA表達(dá)水平均上調(diào), 并與對照無顯著差異。因此脂肪酸合成的減少及脂質(zhì)分解的增加造成了Bs+Ah組及Ah+Bs組脂肪含量低于Ah組且與對照無顯著差異。相關(guān)研究表明, 高脂飼料誘導(dǎo)的脂肪肝羅非魚LPL表達(dá)水平顯著下調(diào), 在高脂飼料中添加垂盆草提取物后則顯著上調(diào)LPL表達(dá)水平[3];用咖啡因治療斑馬魚(Danio rerio)的脂肪肝, 其肝臟ACC1表達(dá)水平顯著地下調(diào)[40], 這些均與本研究相似。56d時Ah組FAS、ACCα、CPTIα1a、HSL、SPEBP-1c、PPARγ和PPARα表達(dá)水平較對照均顯著地下調(diào), 表明Ah組肝臟脂質(zhì)合成和分解均減少,脂質(zhì)代謝異常。在投喂Cu過量飼料后, 黃顙魚ACCα和ATGL表達(dá)水平均顯著下調(diào), 而肝臟脂肪含量減少[41], 與本研究結(jié)果相似。在投喂枯草芽孢桿菌飼料后, 這些基因表達(dá)與對照無顯著差異, 表明在感染嗜水氣單胞菌前后投喂枯草芽孢桿菌飼料均能夠減少因感染嗜水氣單胞菌對草魚脂質(zhì)代謝的影響。

3.5 枯草芽孢桿菌對草魚肝臟抗氧化能力的影響

許多外源因素能誘導(dǎo)體內(nèi)形成過氧化環(huán)境, 導(dǎo)致自由基濃度升高, 進(jìn)而干擾肝臟脂類代謝、破壞細(xì)胞功能, 最終形成肝臟脂質(zhì)積累, 破壞肝臟功能[4]。因此, 氧化應(yīng)激和氧化還原平衡的改變在肝臟脂肪變性的發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用[42]。TAOC是評價機體抗氧化能力的重要指標(biāo)[43]。SOD、CAT、GSH是一類重要的抗氧化酶, 在保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激、預(yù)防或修復(fù)氧化損傷方面發(fā)揮著重要作用, 如SOD能催化轉(zhuǎn)化為H2O2, 而CAT則能清除H2O2[44]。MDA是脂質(zhì)氧化損傷的重要產(chǎn)物,可用于評估脂質(zhì)過氧化程度[5,45]。實驗結(jié)果表明,飼喂含有枯草芽孢桿菌的飼料后, 草魚抗氧化能力顯著提高, 主要反映在肝臟SOD、GSH、CAT、TAOC較Ah組顯著提高; MDA及H2O2含量較Ah組低。已有的研究表明益生菌能夠提高魚類的抗氧化能力: 投喂含有枯草芽孢桿菌的飼料8周后, 團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)幼魚肝臟SOD、CAT、GSH-PX的活性顯著升高, MDA含量顯著降低[46]; 在飼料中補充德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)投喂8周后, 黃河鯉(Cyprinus carpioHuanghe var)肝臟SOD、CAT、GPX活性及T-AOC顯著升高, MDA含量顯著降低[47]。因此, 枯草芽孢桿菌能提高草魚肝臟的抗氧化能力, 減少組織氧化應(yīng)激的發(fā)生, 降低感染嗜水氣單胞菌對肝臟的損害。

4 結(jié)論

以上結(jié)果表明, 在飼料中添加枯草芽孢桿菌可減少嗜水氣單胞菌感染對草魚肝臟功能的損害, 有利于調(diào)節(jié)肝臟正常的脂質(zhì)合成、分解、轉(zhuǎn)運等功能, 減少脂質(zhì)在肝臟中的積累, 并促進(jìn)草魚的生長及降低飼料系數(shù)。