劉盈盈，李彩霞，馮海生，許顯莉，馬世震*

(1. 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008；2. 青海省青藏高原特色生物資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008；3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

桃兒七[Sinopodophyllumhexandrum(Royle)Ying]屬小檗科桃兒七屬多年生草本植物，是一個(gè)分布范圍較廣、生態(tài)適應(yīng)幅度大的物種，主要分布在喜馬拉雅及鄰近地區(qū)，產(chǎn)于云南、四川、西藏、甘肅、青海和陜西[1]，生于林下、林源濕地、灌叢中或草叢中，海拔1500～4300 m[2]。其味甘、性平，有小毒，具有活血化瘀和調(diào)經(jīng)的功能，主要用于治療血瘀、經(jīng)閉和難產(chǎn)等[3]。桃兒七中含有多種化學(xué)成分，主要包括木脂素類和黃酮類，還有皂苷、鞣質(zhì)和多糖等，其中木脂素類主要為鬼臼毒素?，F(xiàn)代藥理研究表明，桃兒七具有抗腫瘤、祛痰止咳、抗炎、抗病毒等多種作用[4]，而鬼臼毒素最顯著的藥理作用是抗腫瘤和抗病毒作用[5]。從桃兒七中高效提取大量鬼臼毒素具有重要意義。

目前，關(guān)于提取鬼臼毒素的研究方法有加熱回流提法[6]、甲醇冷浸法[7]、超聲波輔助提取法[8-12]等，其中超聲波輔助提取法[13-14]優(yōu)點(diǎn)較多。超聲波提取是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型提取技術(shù)，超聲波能促使植物細(xì)胞組織破壁或變形，使有效成分提取更充分，提取速度快，能耗低[15]，具有很好的提取效果。相對(duì)于冷浸法、加熱回流提取法，超聲波輔助提取法具有時(shí)間短、效率高等優(yōu)點(diǎn)。因此，本研究采用超聲波輔助提取法進(jìn)行桃兒七鬼臼毒素提取，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以鬼臼毒素含量為響應(yīng)因子，采用響應(yīng)面法對(duì)提取過(guò)程中主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化，旨在得到鬼臼毒素的最佳提取條件，然后進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，并測(cè)定不同地區(qū)野生桃兒七根部的鬼臼毒素含量，為桃兒七中鬼臼毒素的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)參考。

1 儀器與試劑

1.1 試驗(yàn)儀器

SL-500A型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(浙江省永康市松青五金廠)；BPG-9140A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(一恒科學(xué)儀器有限公司)；ML2047型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；SK3310LHC型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；Agilent Infinity 1260型高效液相色譜儀；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

1.2 試驗(yàn)藥材與試劑

不同產(chǎn)地的桃兒七藥材(見(jiàn)表1)；鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，批號(hào)：17112303，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)；乙腈(色譜純，德國(guó)默克股份兩合公司)；甲酸(色譜純，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司)；甲醇(色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司)。

表1 桃兒七樣品來(lái)源

2 試驗(yàn)方法

2.1 鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品0.001 g，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解并定容至刻度，即得濃度為0.1 μg/μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

精確稱取桃兒七根的干燥粉末0.1 g，粉末過(guò)40目篩，置于具塞試管中，在選定的料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度、以及甲醇體積分?jǐn)?shù)下提取，共三次，每次30 min，抽濾得提取液并定容至10 mL的容量瓶中，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，得供試品溶液。

采用高效液相色譜法對(duì)提取液進(jìn)行測(cè)定，采用下列公式計(jì)算粗提物中鬼臼毒素含量。

m：鬼臼毒素質(zhì)量(g)；M：桃兒七根質(zhì)量(g)

2.3 色譜條件

采用 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈(A)-0.04%甲酸水溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(表2)，流速0.5 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm，進(jìn)樣量10 μL。對(duì)照品和樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

表2 梯度洗脫的流動(dòng)相比例

圖1 鬼臼毒素的對(duì)照品(A)和樣品(B)色譜圖Fig. 1 Chromatogram of control substance (A) and sample (B) of PPT注：a為鬼臼毒素

2.4 線性關(guān)系考察

吸取2.1項(xiàng)下配置的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，依次設(shè)定進(jìn)樣量為2、4、6、8、10、12、14、16 μL，按2.2.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定分析。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

2.5 單因素試驗(yàn)

2.5.1 料液比對(duì)提取效果的影響

在超聲時(shí)間為10 min，超聲溫度為30℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)為100%的條件下，分別按照1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 (g∶mL)的料液比，探究不同料液比對(duì)桃兒七根中鬼臼毒素提取效果的影響。

2.5.2 超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響

在料液比為1∶30 (g∶mL)，超聲溫度為30℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)為100%的條件下，分別按照5，10，15，20，25，30 min的超聲時(shí)間，探究不同超聲時(shí)間對(duì)桃兒七根中鬼臼毒素提取效果的影響。

2.5.3 超聲溫度對(duì)提取效果的影響

在料液比為1∶30 (g∶mL)，超聲時(shí)間為10 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)為100%的條件下，分別按照20，30，40，50，60℃的超聲溫度，探究不同超聲溫度對(duì)桃兒七根中鬼臼毒素提取效果的影響。

2.5.4 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響

在料液比為1∶30 (g∶mL)，超聲時(shí)間為10 min，超聲溫度為30℃的條件下，分別按照20%，40%，60%，80%，100%的甲醇體積分?jǐn)?shù)，探究不同甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)桃兒七根中鬼臼毒素提取效果的影響。

2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

通過(guò)對(duì)上述單因素試驗(yàn)的分析，選出對(duì)試驗(yàn)影響較大的因素，較好的水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，采用Design Expert8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件的響應(yīng)面分析法安排實(shí)驗(yàn)。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了便于工藝操作，將最優(yōu)參數(shù)調(diào)整為：料液比為1∶40 (g∶mL)，超聲時(shí)間為21 min，超聲溫度為56℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)為82%，進(jìn)行三次平行提取試驗(yàn)。

2.8 桃兒七中鬼臼毒素含量測(cè)定

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)得到的最優(yōu)參數(shù)，對(duì)不同地區(qū)的桃兒七干燥根進(jìn)行鬼臼毒素含量測(cè)定分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性關(guān)系考察結(jié)果

由2.4項(xiàng)下得回歸方程和線性范圍，見(jiàn)表3。

表3 線性關(guān)系

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖2A可知，在溫度為20℃和30℃時(shí)，鬼臼毒素含量基本無(wú)變化，但隨著溫度增加到60℃時(shí)，鬼臼毒素含量急劇增加，這與周艷紅等人[16]的研究相似。表明溫度低時(shí)，鬼臼毒素溶出較慢，所以最終溫度確定為60℃。

由圖2B可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，鬼臼毒素的含量先增后降，在超聲時(shí)間為20 min時(shí)，鬼臼毒素的含量達(dá)到最大值，隨著時(shí)間增加，鬼臼毒素含量則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，得到與李玲等人[17]的研究相一致的結(jié)果。這可能是由于超聲波輔助提取超過(guò)一定時(shí)間，提取溶劑損失量增加，鬼臼毒素的穩(wěn)定性變差，同時(shí)引起其他物質(zhì)溶出，使鬼臼毒素含量相對(duì)下降。所以確定超聲時(shí)間為20 min時(shí)，為單因素試驗(yàn)的最佳條件。

由圖2C可知，隨著提取液的增加，鬼臼毒素含量先增加后下降，在料液比1∶40 (g∶mL)時(shí)達(dá)到最大值，再增加提取液，鬼臼毒素含量明顯下降，所以確定料液比為1∶40 (g∶mL)時(shí)，為單因素試驗(yàn)最佳條件。

由圖2D可知，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加，鬼臼毒素含量先是急劇上升的趨勢(shì)，然后平緩上升，直到甲醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時(shí)，鬼臼毒素含量開(kāi)始下降。這與崔文燕等人[18]的研究相似，可能是由于甲醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)適宜甲醇體積分?jǐn)?shù)會(huì)增加其他物質(zhì)的溶出，降低鬼臼毒素的相對(duì)含量，而且提高了投料成本，所以最終確定甲醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與回歸模型的建立

由2.6項(xiàng)下得超聲波提取桃兒七根中鬼臼毒素的最佳因素水平(見(jiàn)表4)。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

綜合考慮單因素結(jié)果，響應(yīng)面分析結(jié)果見(jiàn)表5。從表5中可以看出，料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度和甲醇體積分?jǐn)?shù)的中心點(diǎn)試驗(yàn)值(鬼臼毒素含量)均高于析因點(diǎn)試驗(yàn)，這與單因素試驗(yàn)的結(jié)果相吻合，說(shuō)明該響應(yīng)面設(shè)計(jì)的29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)可信度較高。

3.3.2 回歸模型的方差分析

利用Design-expert 8.0.6 軟件對(duì)表5試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得二次多元回歸方程：

Y=1.52+0.021*A+0.031*B+0.025*C+0.025*D+(7.500E-003)*AB-0.022*AC-0.017*AD-0.052*BC+(2.500E-003)*BD-(5.000E-003)*CD-0.061*A2-0.051*B2-0.047*C2-0.057*D2。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)表

從表6可知，該回歸模型P<0.0001，表明該回歸模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而失擬項(xiàng)P>0.05不顯著，同時(shí)R2=0.9584與Radj2=0.9169都接近1，表明該模型的可靠程度較高，對(duì)試驗(yàn)的擬合度較好，從而該回歸方程可代替實(shí)際值對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。另外從分析結(jié)果可知，料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度及甲醇體積分?jǐn)?shù)四個(gè)因素對(duì)鬼臼毒素含量的影響都極顯著，從F值可判斷，四種因素對(duì)鬼臼毒素含量的影響順序?yàn)椋撼晻r(shí)間(B)>超聲溫度(C)=甲醇體積分?jǐn)?shù)(D)>料液比(A)。

表6 回歸方程方差分析

注：P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著

3.3.3 兩因素交互影響的響應(yīng)面分析

對(duì)料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度及甲醇體積分?jǐn)?shù)四因素進(jìn)行交互作用分析，結(jié)果如圖3所示。響應(yīng)面可以直觀的反映各試驗(yàn)因素對(duì)鬼臼毒素含量影響的大小，響應(yīng)面的坡度越陡，說(shuō)明鬼臼毒素含量對(duì)該試驗(yàn)因素的改變?cè)矫黠@；反之，坡度越緩，該因素對(duì)鬼臼毒素含量的影響越不明顯。響應(yīng)面在底面的投影為等高線圖，等高線的性狀反映了兩兩因素交互作用的強(qiáng)弱，圓形表示兩兩因素交互作用不顯著，而橢圓表示兩兩因素交互作用顯著。從圖3中可看出，超聲時(shí)間的響應(yīng)面坡度最陡，超聲溫度和甲醇體積分?jǐn)?shù)次之，料液比最緩。超聲溫度與超聲時(shí)間的交互作用對(duì)鬼臼毒素含量的影響尤其顯著，其原因主要是物料在超聲輔助提取過(guò)程中，限定的超聲時(shí)間和超聲溫度對(duì)目標(biāo)化合物的提取起決定性作用[19]。通過(guò)Design Expert 軟件分析，超聲波輔助提取桃兒七中的鬼臼毒素最優(yōu)參數(shù)為：料液比為1∶40.3 (g∶mL)，超聲時(shí)間為20.86 min，超聲溫度為55.74℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)為81.99%，在此條件下，桃兒七中鬼臼毒素提取含量的理論值為1.53%。

3.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

結(jié)果表明，在此提取條件下，鬼臼毒素的實(shí)際含量測(cè)得1.52%(n=3)，與理論值相近。說(shuō)明此法具有一定的參考價(jià)值。

3.4 不同地區(qū)桃兒七中鬼臼毒素的含量結(jié)果

由表7可看出，西藏地區(qū)桃兒七中鬼臼毒素的含量最高，甘肅地區(qū)桃兒七中鬼臼毒素的含量最低，四川汶川桃兒七中鬼臼毒素含量次之，其中甘肅部分地區(qū)和四川汶川地區(qū)、湖北地區(qū)和青海玉樹地區(qū)桃兒七中鬼臼毒素含量無(wú)顯著差異，其余地區(qū)均有顯著差異。

表7 不同地區(qū)桃兒七中鬼臼毒素含量(n=3)

Table 7 The content of PPT inS.hexandrumin different areas(n=3)

樣品編號(hào)含量(%)S11.78±0.02dS20.73±0.02hS30.76±0.03hS41.32±0.02gS51.90±0.04cS61.47±0.02fS71.52±0.01fS83.87±0.01bS91.58±0.02eS104.28±0.01a

注：同列不同小寫字母表示差異顯著，P<0.05

4 討論

本研究針對(duì)不同地區(qū)的桃兒七進(jìn)行了含量測(cè)定，明確測(cè)定了不同地區(qū)的桃兒七中鬼臼毒素含量，得到西藏地區(qū)桃兒七中鬼臼毒素含量最高。李敏等人[20]測(cè)定了青海、西藏、四川、云南、甘肅地區(qū)的桃兒七鬼臼毒素，得出西藏的桃兒七中鬼臼毒素含量最高的結(jié)論，與本研究結(jié)論基本一致。這可能是由于西藏獨(dú)特的地理位置以及氣候有利于桃兒七中鬼臼毒素積累合成，也說(shuō)明青藏高原地區(qū)桃兒七藥材的品質(zhì)相對(duì)較佳。本研究中有些地區(qū)含量高低不同的可能原因是不同產(chǎn)地的土壤、降水、氣候等因素的影響以及采集的野生藥材生長(zhǎng)年限不同和采集月份不同導(dǎo)致。劉世巍等人[21]采用回流提取的方法測(cè)得桃兒七中鬼臼毒素含量為0.017%；李艷玲等人[22]用超聲輔助提取法測(cè)得桃兒七中鬼臼毒素的含量為1.05%；Liu等人[23]采用真空泡狀輔助溶劑萃取法測(cè)得桃兒七中鬼臼毒素的含量為2.24%。本研究采用超聲輔助提取法測(cè)得不同地區(qū)的桃兒七中鬼臼毒素含量為0.74～4.18%，相對(duì)高于其他方法的提取含量，在生產(chǎn)實(shí)踐中具有一定的參考價(jià)值，為今后桃兒七的鬼臼毒素提取分離和藥材品質(zhì)鑒別選擇提供了科學(xué)依據(jù)和參考。

5 結(jié)論

本研究采用響應(yīng)面法對(duì)桃兒七中鬼臼毒素的超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。影響桃兒七鬼臼毒素超聲提取效果的主要因素包括料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度、甲醇體積分?jǐn)?shù)。因此，選取料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度、甲醇體積分?jǐn)?shù)為考察因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面分析法對(duì)桃兒七鬼臼毒素的超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。由方差分析可知，上述4個(gè)因素對(duì)桃兒七鬼臼毒素得率的影響程度為超聲時(shí)間(B)>超聲溫度(C)=甲醇體積分?jǐn)?shù)(D)>料液比(A)。利用響應(yīng)面優(yōu)化后，桃兒七鬼臼毒素最佳超聲輔助提取工藝為料液比1∶40.3 (g∶mL)，超聲時(shí)間20.86 min，超聲溫度55.74℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)81.99%。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，證明本模型工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，能夠較好地預(yù)測(cè)實(shí)際情況，表明采用超聲輔助提取桃兒七中鬼臼毒素切實(shí)可行，穩(wěn)定性好，高效便捷。在此條件下，對(duì)不同地區(qū)的桃兒七干燥根中鬼臼毒素含量進(jìn)行測(cè)定，不同產(chǎn)區(qū)的桃兒七鬼臼毒素含量以西藏地區(qū)市場(chǎng)桃兒七中鬼臼毒素的含量最高，為4.18%。因此，本研究能夠?yàn)樘覂浩咛崛∥锏纳a(chǎn)提供試驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為中藥材的提取工藝提供一定的理論指導(dǎo)。