黃建華，謝思敏，彭清華，李正治，張遠芳，王俊杰

(湘南學(xué)院 藥學(xué)院，湖南 郴州 423000)

藤茶，屬葡萄科植物顯齒蛇葡萄(Ampelopsisgrossedentata)，又名白茶、龍須茶、甜茶、霉茶等，主要分布于我國湖南、福建、貴州、湖北、廣西等長江以南地區(qū)[1]。藤茶在湖南張家界當?shù)厮追Q土家神茶，青安莓茶，神仙草等，普通茶隔夜不能喝，易變餿，而藤茶沏泡一星期仍可飲用[2]。現(xiàn)代研究表明藤茶具有清熱解毒、抗菌消炎、祛風除濕、降血脂、降血糖、保肝護肝等功效[3]。藤茶中主要活性成分是以二氫楊梅素為代表的黃酮類物質(zhì)，二氫楊梅素具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌、抗腫瘤、抗氧化等活性[4-7]，其在藤茶中的含量經(jīng)高效液相色譜檢測可高達25.5%[8]，且4～6月份藤茶中二氫楊梅素的含量高于其他月份[9-11]。鑒于藤茶巨大的應(yīng)用價值和市場潛力，目前關(guān)于藤茶的研究很多，但其質(zhì)量研究基本都集中在二氫楊梅素及總黃酮的含量測定上，且檢測方法多，沒有統(tǒng)一標準，結(jié)果差異性較大[12-19]。此外藤茶作為一款茶飲品，其感官如何尚未見到相關(guān)文獻報道。

本研究在已有的藤茶研究基礎(chǔ)上，首次采用感官審評的方法，并運用高效液相色譜-二極管陣列檢測器法(HPLC-DAD)建立穩(wěn)定高效的藤茶中二氫楊梅素含量測定方法，同時結(jié)合感官品質(zhì)和主要活性成分含量綜合評價藤茶質(zhì)量，為藤茶資源更加合理的利用與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀，包括自動進樣器和DAD檢測器(LC-20AT型，日本島津公司)；色譜柱InertSustain?C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm，日本島津公司)；超聲波清洗機(KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司)；電子天平(AUW120D型，日本島津公司)；電熱鼓風干燥箱(DHG-9140A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 材料與試劑

4、5、6月份的野生藤茶均于2017年采自湖南省郴州宜章地區(qū)，經(jīng)湘南學(xué)院王俊杰教授鑒定均為葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄(A.grossedentata)的葉和莖，樣本保存于湘南學(xué)院藥學(xué)院湖南省心腦血管天然藥物研究重點實驗室。

二氫楊梅素標準品(純度 ≥ 98%，上海源葉生物科技有限公司)；色譜甲醇，F(xiàn)isher Chemical(賽默飛世爾科技有限公司)；磷酸(國產(chǎn)分析純，天津科密歐公司)；娃哈哈純凈水(市購)。

1.3 試驗方法

1.3.1 感官審評

1.3.1.1 感官審評方法 本試驗參照GB/T23776-2018《茶葉感官審評辦法》[20]并進行了適當修改，對4、5、6月份的藤茶茶樣進行審評：3 g茶樣，100 mL水，沸水沖泡5 min制備茶湯，進行感官審評。分別從外形(20分)、湯色(10分)、香氣(30分)、滋味(30分)、葉底(10分)4個因子，由7名評茶員對3種茶樣進行感官審評后，各因子取平均值，再按加權(quán)平均法算出總分值，得分越高，反映藤茶的品質(zhì)越好。

1.3.1.2 感官審評因子 藤茶審評中：外形以干茶寬粗，不硬不軟，色澤均勻，明亮，夾雜物少，完整為優(yōu)質(zhì)；湯色以色澤均勻，渾濁少，亮綠或淺綠色，清澈明亮為優(yōu)質(zhì)；香氣以保有茶類原有香味，香味濃醇，持久為優(yōu)質(zhì)；滋味以茶味鮮濃純正，回味甘甜為優(yōu)質(zhì)；葉底以葉底嫩，色澤均勻，黃綠色，明亮勻整為優(yōu)質(zhì)。

1.3.1.3 計算公式 感官總得分 = 外形得分×20%+湯色得分×10%+香氣得分×30%+滋味得分×30%+葉底得分×10%。

1.3.2 含量測定

1.3.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 色譜柱為島津InertSustain?C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇(A)∶0.05%磷酸水(B)=45∶55，等度洗脫30 min；檢測波長290 nm，柱溫30℃，流速0.8 mL/min，進樣10 μL。在該色譜條件下，二氫楊梅素的理論塔板數(shù)不低于3500，分離度大于1.5。對照品溶液和供試品溶液色譜圖見圖1～2。

圖1 二氫楊梅素對照品HPLC圖譜Fig. 1 HPLC chromatogram of dihydromyricetin

圖2 藤茶原料HPLC圖譜Fig. 2 HPLC chromatogram of material sample

1.3.2.2 對照品溶液制備 精確量取二氫楊梅素標準品3.71 mg，于20 mL容量瓶，配成0.186 mg/mL的標準液作為母液。再精密量取母液分別稀釋成二氫楊梅素濃度為0.030917，0.023186，0.01855，0.011593，0.005796 mg/mL的標準品溶液，分別經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾后作為供試品溶液，待測。

1.3.2.3 供試樣品液制備 將4、5、6月份采摘的藤茶干燥樣品分別粉碎后過80目篩，各取1.0 g，于20 mL容量瓶中，加入甲醇超聲30 min，甲醇定容，配成濃度為50 mg/mL樣品溶液，再各取1 mL稀釋成1.0 mg/mL的樣品溶液，分別經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾后作為供試品溶液，待測。

1.3.2.4 線性關(guān)系考察 取二氫楊梅素標準品濃度為0.030917，0.023186，0.01855，0.011593，0.005796 mg/mL的標準品溶液，在上述色譜條件下精確量取10 μL平行進樣兩次，以樣品濃度(X)對出峰面積平均值(Y)進行線性回歸得到回歸方程：Y=195959X-29397(R2=0.9994)，線性范圍為5.796～30.917 μg/mL。

1.3.2.5 精密度試驗 精密量取濃度為0.030917 mg/mL二氫楊梅素標準品，在上述色譜條件下連續(xù)進樣6次，每次10 μL，根據(jù)二氫楊梅素的峰面積數(shù)值，計算RSD值為0.77%，表明儀器精密度良好。

1.3.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取4月份樣品的供試品溶液，分別于制備后的0、2、4、8、12、16、24 h進樣10 μL測定，根據(jù)二氫楊梅素的峰面積數(shù)值，計算RSD值為1.49%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.3.2.7 重復(fù)性試驗 取4月份樣品適量，精密稱定，按“1.3.2.3”項中方法平行制備供試品溶液6份，分別進樣10 μL，測定峰面積，計算二氫楊梅素的質(zhì)量分數(shù)RSD值為1.24%，表明該方法重復(fù)性較好。

1.3.2.8 加樣回收率試驗 取4月份樣品粉末(過80目篩)6份，各0.2 g，精密加入5.0 mg二氫楊梅素對照品，按“1.3.2.3”項中方法制備供試品溶液，分別進樣10 μL，測定峰面積，計算二氫楊梅素的加樣回收率和RSD值。測得二氫楊梅素的平均加樣回收率為98.97%，RSD值為1.91%，表明該方法的準確度良好。

1.3.2.9 樣品測定 取4、5、6月份藤茶樣品各20 g，粉碎過80目篩，精密稱取各樣品約1.0 g，每個樣品平行稱2份，按“1.3.2.3”項中方法制備供試品溶液，并按“1.3.2.1”項中色譜條件進行二氫楊梅素的含量分析，測定峰面積，取平均值代入回歸方程計算樣品中的二氫楊梅素的質(zhì)量分數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 感官審評結(jié)果

不同月份藤茶的感官審評結(jié)果如下表1。

從表1中可知，4～6月份的藤茶感官品質(zhì)均較好，且隨著月份遞增品質(zhì)呈增加趨勢，其中香氣、滋味和葉底均逐漸增加。而外形和湯色不明顯，可能是由于人工采摘和加工過程進行控制的結(jié)果。

2.2 含量測定結(jié)果

在“1.3.2.1”色譜條件下，不同月份藤茶樣品中的二氫楊梅素的含量測定結(jié)果如下表2。

從表2中可知，4～6月份的藤茶中二氫楊梅素含量均比較高，其中4月份的含量最高，達34.06%，然后逐月遞減，6月份的含量仍有28.19%。

表2 藤茶樣品中二氫楊梅素含量測定結(jié)果

3 討論

已有研究表明不同產(chǎn)地和不同采摘時間對藤茶中二氫楊梅素含量均有較大影響[10-11,15]，而圍繞藤茶本身作為一種茶飲品的感官研究鮮見報道。本試驗首次發(fā)現(xiàn)湖南省郴州市宜章地區(qū)4～6月份的藤茶中二氫楊梅素的含量較高，且呈逐月遞減趨勢，其中4月份的含量可高達34%以上，明顯優(yōu)于文獻報道的25.5%[8]，且本研究建立的HPLC-DAD檢測方法操作簡便，結(jié)果可靠。感官研究發(fā)現(xiàn)，4～6月份的藤茶品質(zhì)整體較好，且呈逐月遞增趨勢，其中6月份的藤茶感官品質(zhì)最好，這些結(jié)果提示藤茶的質(zhì)量受月份影響明顯，且感官品質(zhì)和二氫楊梅素的含量存在差異性變化。故為了更加合理有效地開發(fā)和利用藤茶資源，不能簡單以二氫楊梅素含量水平作為單一評價指標，需結(jié)合感官品質(zhì)以及原料產(chǎn)地、外觀性狀、采收時間等多種因素進行綜合評價。例如4月份的藤茶二氫楊梅素含量最高，更適合用于二氫楊梅素的提取，而6月份的藤茶口感最佳，更適合用于藤茶飲品的制作。在后續(xù)研究中，還需進一步對更多的藤茶資源及其品質(zhì)進行考察，分析探究藤茶中的呈味成分與活性成分的關(guān)系，以期建立并完善藤茶質(zhì)量的綜合評價體系。