張 武，吳雁斌，高彥萍，梁宏杰，呂和平*

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省馬鈴薯脫毒種薯（種苗）病毒檢測及安全性評價工程中心，甘肅 蘭州 730070）

據(jù)研究，有40多種病毒和2種類病毒可以感染馬鈴薯，其中9種病毒和1種類病毒對馬鈴薯生長的影響最為嚴(yán)重[1-3]。馬鈴薯Y 病毒（Potato virus Y，PVY）和馬鈴薯卷葉病毒（Potato leaf roll virus，PLRV）是世界范圍內(nèi)影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的2種主要的馬鈴薯病毒病原體[4]。如果馬鈴薯被PVY 或PLRV 感染，一個生長季節(jié)的總產(chǎn)量會減少80%，導(dǎo)致塊莖質(zhì)量不合格，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。多年來，馬鈴薯病毒的研究主要集中在馬鈴薯病毒的莖尖脫毒和檢測分析[6-8]。人們對植物抗逆性生理與酶活性的關(guān)系進(jìn)行了大量的研究，并解釋了逆境環(huán)境下植物酶活性的變化[9,10]。Fridovich[11]的自由基理論認(rèn)為，植物存在一種膜保護(hù)系統(tǒng)，可以清除植物體內(nèi)多余的自由基。逆境條件下，膜保護(hù)系統(tǒng)實(shí)際上是一種抗氧化系統(tǒng)，由超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase， SOD）、 過氧化物酶（Peroxidase，POD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）等組成，試驗(yàn)表明，植物受到蟲害威脅后，SOD、POD、CAT活性增加。與此同時，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，受病原菌侵染的植株光合速率明顯降低，葉綠體結(jié)構(gòu)被破壞，葉綠素含量下降[12]。本試驗(yàn)通過測定和分析馬鈴薯中早熟品種‘LK99’和晚熟品種‘隴薯3號’感染PVY 和PLRV 后葉片SOD 活性、POD 活性、CAT 活性、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量、葉綠素含量的變化，旨在進(jìn)一步明確和比較所選兩個品種分別在2種病毒脅迫下的生理變化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2016 年在甘肅省定西市渭源縣會川鎮(zhèn)甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行，試驗(yàn)地土壤為黑麻土，土壤pH 7.6，有機(jī)質(zhì)含量18.0 g/kg，全氮0.84 g/kg，堿解氮78 mg/kg，速效磷7.6 mg/kg，速效鉀109.7 mg/kg。溫帶大陸性氣候，馬鈴薯生育期均降水量300 mm，平均氣溫18 ℃。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所育成馬鈴薯晚熟品種‘隴薯3 號’（生育期出苗至成熟110 d左右），以下簡稱L3和中早熟品種‘LK99’（生育期85 d左右）的一級種薯。馬鈴薯播種期為4月26日，出苗期后田間目測、結(jié)合免疫試紙條法[安德珍（Adgen）公司試劑盒]田間檢測，選取正常和分別感PVY和PLRV植株葉片，經(jīng)ELISA病毒檢測，確定只含PVY或PLRV的植株，并分別用防蟲網(wǎng)和小拱棚對此植株進(jìn)行隔離，以防蚜蟲等傳毒媒介傳染其他病毒，從而影響試驗(yàn)結(jié)果。并于6 月14 日（苗期）、7 月2 日（塊莖形成期）、7 月24 日（塊莖膨大期）、8月17日（淀粉積累期）選取正常葉和感病植株（花葉、卷葉明顯），每株取上中部3片復(fù)葉進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定，首次取樣用免疫試紙條法[安德珍（Adgen）公司試劑盒]結(jié)合ELISA病毒檢測確定，后期取樣只用免疫試紙條法[安德珍（Adgen）公司試劑盒]確認(rèn)，在塊莖膨大期測定株高、莖粗、地上鮮重，成熟后測產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酶液的制備

取0.2 g 新鮮馬鈴薯葉片于冰浴研缽中，加少許石英砂和5 mL預(yù)冷的酶提取液（用pH 7.8的磷酸緩沖液配制，內(nèi)含5 mmol/L EDTA，2 mmol/L AsA，2%PVP），迅速勻漿，4 ℃，4 000 r/min離心15 min，取上清液備用。上清液中包含POD、SOD和CAT[13]。

1.3.2 POD活性的測定

0.3%愈創(chuàng)木酚法[13]。以470 nm吸光值每分鐘增加1為一個酶活性單位（U）。

1.3.3 SOD活性的測定

NBT光還原法[14]，以抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光照下被還原到50%的酶量為一個酶活性單位（U）。

1.3.4 CAT活性的測定

240 nm比色法[14]，以240 nm吸光值每分鐘減小0.1為一個酶活性單位（U）計算CAT活性。

1.3.5 MDA含量的測定

雙組分分光光度計法[15]，稱取0.3 g 馬鈴薯葉片和嫩莖，加入5 mL 三氯乙酸（TCA），研磨后在4 000 r/min 離心15 min，吸取2 mL 上清液再加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸（TBA）溶液，沸水浴15 min，迅速冷卻，測定450，532和600 nm處吸光值。

1.3.6 葉綠素含量的測定

無水乙醇與丙酮（1∶1，v/v）混合液浸泡法[16]，0.1 g樣品加10 mL提取液（無水乙醇∶丙酮=1∶1），封口，遮光，24 h后測定470，649和665 nm處吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

受到PVY、PLRV 侵染的馬鈴薯葉片中POD、SOD和CAT酶活及MDA含量、葉綠素含量相對增量（減量）按以下公式計算：

酶活相對增量（%）=[處理組酶活（含量）-對照組酶活（含量）]/[對照組酶活（含量）]×100

酶活相對減量（%）=[對照組酶活（含量）-處理組酶活（含量）]/[對照組酶活（含量）]×100

使用Microsoft Excel 2007 軟件作圖，SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素隨機(jī)區(qū)組方差分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒侵染對馬鈴薯生長及產(chǎn)量的影響

晚熟馬鈴薯品種‘隴薯3 號’和中早熟品種‘LK99’感病植株與正常植株相比，感病植株株高較正常植株株高降低4.7～12.1 cm；植株莖粗2個品種均表現(xiàn)為正常植株＞感染PLRV植株＞感染PVY植株，但差異不顯著；同時表現(xiàn)為植株單株鮮重和單株薯重急劇降低，感染PVY 的‘隴薯3 號’和‘LK99’植株單株鮮重分別減少79 和38 g、單株薯重分別減少257 和145 g，感染PLRV 的‘隴薯3 號’和‘LK99’植株單株鮮重分別減少44 和19 g、單株薯重分別減少126和104 g（表1）。

表1 病毒侵染對馬鈴薯農(nóng)藝性狀的影響Table 1 Effect of virus infection on agronomic traits of potato

從2種病毒對植株的影響分析，株高方面感染PLRV的植株損傷明顯重于感染PVY的植株，而莖粗、單株鮮重、單株薯重則表現(xiàn)為感染PLRV的植株損傷明顯輕于感染PVY的植株。從2個不同馬鈴薯品種對病毒的響應(yīng)分析，感染PVY后‘LK99’在株高、單株鮮重、單株薯重方面均表現(xiàn)為受損程度顯著低于‘隴薯3號’植株；當(dāng)感染PLRV后‘LK99’在株高、單株鮮重方面表現(xiàn)與感染PVY 后的情況一致，但是植株分別感染2種病毒后莖粗表現(xiàn)呈現(xiàn)相反的情況（表2）。這可能表明PVY對馬鈴薯的危害程度較PLRV更為嚴(yán)重，PVY和PLRV對‘隴薯3號’的損傷程度較‘LK99’嚴(yán)重。

表2 病毒侵染后馬鈴薯農(nóng)藝性狀的相對減量Table 2 Relative decrement of potato agronomic traits after virus infection

2.2 病毒侵染對馬鈴薯細(xì)胞保護(hù)酶活性的影響

2.2.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性的變化

無論是正常馬鈴薯植株，還是分別感染PVY、PLRV的馬鈴薯植株，SOD活性隨著生育期進(jìn)程的推進(jìn)均呈明顯上升趨勢，到塊莖膨大期達(dá)到最高值，至淀粉積累期開始下降；‘隴薯3號’及‘LK99’植株分別感染PVY、PLRV 后，各生育階段植株葉片的SOD活性相對于未感病植株均顯著增強(qiáng)（圖1）。

從品種方面分析，在4 個生育期內(nèi)分別感染PVY 和PLRV 的‘隴薯3 號’植株葉片SOD 活性相對增量顯著高于分別感染PVY 和PLRV 的‘LK99’（淀粉積累期PVY 除外）。從兩種病毒的危害程度方面分析，感染PVY 后‘隴薯3 號’植株葉片SOD 活性相對增量顯著低于感染PLRV 的‘隴薯3 號’植株，除淀粉積累期以外，‘LK99’也具有相似的表現(xiàn)（表3）。

表3 病毒侵染后馬鈴薯葉片SOD活性相對增量Table 3 Relative increment of SOD activity in potato leaves after virus infection

2.2.2 過氧化物酶（POD）活性的變化

感染了PVY 的2 個品種植株各生育時期葉片POD活性均顯著高于正常植株葉片POD活性，感染PLRV的兩個品種植株除淀粉積累期外葉片POD活性均顯著高于正常植株葉片POD活性。其總體趨勢表現(xiàn)為幼苗期POD 活性值較低（16.73～36.28 U/g），到塊莖形成期急劇升高，達(dá)到最大值（29.80～71.21 U/g），到塊莖膨大期急劇下降（21.64～35.77 U/g，和幼苗期POD酶活性值相近），到淀粉積累期下降到最低點(diǎn)（14.17～21.37 U/g）（圖2）。

從品種方面分析，在4個生育期內(nèi)感染PLRV的‘隴薯3號’植株葉片POD活性相對增量顯著高于感染PLRV的‘LK99’；感染PVY的‘隴薯3號’植株葉片POD活性相對增量在幼苗期和淀粉積累期內(nèi)顯著高于感染PVY的‘LK99’，而在塊莖形成期和塊莖膨大期感染PVY的‘隴薯3號’植株葉片POD活性相對增量顯著低于感染PVY的‘LK99’。從兩種病毒的危害程度方面分析，感染PVY后‘隴薯3號’植株葉片POD活性相對增量在幼苗期、塊莖形成期、塊莖膨大期顯著低于感染PLRV的‘隴薯3號’，在淀粉積累期卻相反；感染PVY后‘LK99’植株葉片POD活性相對增量在幼苗期、塊莖形成期顯著低于感染PLRV的‘LK99’，而在塊莖膨大期、淀粉積累期卻相反（表4）。

表4 病毒侵染后馬鈴薯葉片POD活性相對增量Table 4 Relative increment of POD activity in potato leaves after virus infection

2.2.3 過氧化氫酶（CAT）活性的變化

無論是未感染病毒的馬鈴薯品種，還是已被PVY、PLRV 感染的馬鈴薯品種，其植株體內(nèi)CAT活性的變化隨著生育期進(jìn)程的推進(jìn)呈線性升高趨勢，到淀粉積累期植株體內(nèi)CAT活性值上升到最高點(diǎn)。并且同一品種內(nèi)，除感染了PLRV的‘隴薯3號’在幼苗期與未感病的‘隴薯3 號’沒有顯著差異之外，其他生育期內(nèi)感染了PVY或PLRV的兩個馬鈴薯品種植株葉片的CAT活性均顯著高于未感病植株葉片的CAT活性，且差異顯著（圖3）。

從品種方面分析，在4個生育期內(nèi)感染了PVY的‘隴薯3號’植株葉片CAT活性相對增量均高于感染PVY了的‘LK99’，但是只在幼苗期和淀粉積累期差異顯著；感染了PLRV的‘隴薯3號’植株葉片CAT活性相對增量在塊莖形成期和淀粉積累期內(nèi)顯著高于感染了PLRV的‘LK99’，而在幼苗期和塊莖膨大期差異不顯著。從2 種病毒的危害程度方面分析，感染了PVY的‘隴薯3號’和‘LK99’植株葉片CAT活性相對增量在4個生育期內(nèi)均顯著高于感染了PLRV的‘隴薯3號’和‘LK99’（表5）。

2.3 丙二醛（MDA）含量的變化

無論是未感染病毒的馬鈴薯品種，還是已被PVY、PLRV 病毒感染的馬鈴薯品種，其植株體內(nèi)MDA 含量的變化隨著生育期進(jìn)程的推進(jìn)呈上升趨勢，到淀粉積累期達(dá)到最高，這可能與植株的老化進(jìn)程有關(guān)。從兩個品種整體而言，植株體內(nèi)MDA含量均表現(xiàn)為感染了PLRV的植株＞感染了PVY的植株＞未感染病毒植株，這可能表明PLRV對植株細(xì)胞膜的破壞程度較PVY嚴(yán)重（圖4）。

從品種方面分析，在4個生育期內(nèi)感染了PVY的‘隴薯3號’植株葉片MDA含量相對增量均顯著高于感染了PVY的‘LK99’；感染了PLRV的‘隴薯3號’植株葉片MDA含量相對增量在幼苗期、塊莖形成期和淀粉積累期內(nèi)顯著高于感染了PLRV的‘LK99’，而在塊莖膨大期表現(xiàn)相反。從兩種病毒的危害程度方面分析，感染了PVY的‘隴薯3號’和‘LK99’植株葉片MDA含量相對增量在4個生育期內(nèi)均顯著低于感染了PLRV的‘隴薯3號’和‘LK99’（表6）。

表5 病毒侵染后馬鈴薯葉片CAT活性相對增量Table 5 Relative increment of CAT activity in potato leaves after virus infection

表6 病毒侵染后馬鈴薯葉片MDA含量相對增量Table 6 Relative increment of MDA content in potato leaves after virus infection

2.4 病毒侵染對馬鈴薯植株葉片葉綠素含量的影響

2個品種正常植株葉片中總?cè)~綠素含量均顯著高于感病植株，且‘LK99’植株葉片中總?cè)~綠素含量顯著低于‘隴薯3號’，感染了PVY植株的葉片葉綠素含量顯著高于感染了PLRV的植株；同時，兩個正常品種植株隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)，葉片中總?cè)~綠素含量逐步升高，在塊莖膨大期達(dá)到最大值，為幼苗期的119.7%～158.0%，然后葉片中總?cè)~綠素含量開始降低到低于幼苗期總?cè)~綠素含量；感染PVY或PLRV植株葉片中總?cè)~綠素含量到塊莖形成期達(dá)到最高，然后開始下降，到淀粉積累期下降到幼苗期的7.7%～20.6%（圖5）。可能說明馬鈴薯植株感染PVY或PLRV 后，葉綠體結(jié)構(gòu)和功能受到破壞或干擾，使體內(nèi)葉綠素的合成受阻，也可能是病毒導(dǎo)致葉綠素分解酶活性上升，從而使葉綠素含量下降。

從品種方面分析，在幼苗期兩個品種總?cè)~綠素含量相對減量無顯著差異，在其他3 個生育期內(nèi)分別感染了PVY 和PLRV 的‘隴薯3 號’植株葉片總?cè)~綠素含量相對減量均顯著高于分別感染了PVY 和PLRV 的‘LK99’。從2 種病毒的危害程度方面分析，感染了PVY 的‘隴薯3 號’和‘LK99’植株葉片總?cè)~綠素含量相對減量在4 個生育期內(nèi)均低于感染了PLRV 的‘隴薯3 號’和‘LK99’，但是只有在塊莖形成期的‘隴薯3 號’和幼苗期、塊莖膨大期的‘LK99’植株葉片總?cè)~綠素含量相對減量差異顯著（表7）。

表7 病毒侵染后馬鈴薯葉片葉綠素含量相對減量Table 7 Relative decrement of chlorophyll content in potato leaves after virus infection

3 討 論

本研究測定了馬鈴薯植株農(nóng)藝性狀以及馬鈴薯葉片的一些生理生化指標(biāo)，在一定程度上解釋了馬鈴薯植株感染馬鈴薯Y病毒（PVY）和馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）后的植株變化。植株的株高、莖粗、單株鮮重、單株薯重都是評價馬鈴薯農(nóng)學(xué)特性的重要指標(biāo)，研究中馬鈴薯植株感染病毒后，株高、莖粗、單株鮮重、單株薯重都不同程度的表現(xiàn)為降低的趨勢，這與理論上的預(yù)期是相符的，植株感病后細(xì)胞受到病毒的傷害，細(xì)胞的正常生理生化受到影響，進(jìn)而影響了細(xì)胞的物質(zhì)合成，最終導(dǎo)致植株的部分農(nóng)藝特性降低，例如株高變矮、鮮重及薯重降低（表1）。本試驗(yàn)顯示PLRV對植株株高的影響顯著大于PVY，而在莖粗、鮮重、薯重方面PVY的影響更為顯著；數(shù)據(jù)也顯示了PVY對‘隴薯3號’的影響顯著大于‘LK99’，PLRV對‘隴薯3號’的影響也顯著大于‘LK99’（表2）。綜合以上結(jié)果可能說明在農(nóng)藝性狀方面PVY對植株的損傷程度較PLRV嚴(yán)重，晚熟品種‘隴薯3號’對PVY或PLRV的反應(yīng)比中早熟品種‘LK99’敏感。

活性氧的變化可以作為植物生理生化變動的指標(biāo)[17,18]，病毒病是影響植物正常生理生化代謝以及導(dǎo)致植物過早衰老的重要因素，當(dāng)植株受到病原物侵染后植株體內(nèi)活性氧含量將會增加，此時SOD、POD、CAT 等重要的內(nèi)源性活性氧清除劑會被啟動，并產(chǎn)生一系列不同程度的生化反應(yīng)[19,20]。有研究發(fā)現(xiàn)葡萄花葉病毒會導(dǎo)致葡萄活性氧的積累，當(dāng)番茄和黃瓜受到病毒侵染后葉片中SOD 活性明顯升高[21,22]，本試驗(yàn)研究結(jié)果也顯示植株感病后SOD、POD、CAT活性明顯增強(qiáng)，可能說明在病毒脅迫下植株體內(nèi)產(chǎn)生了更多的活性氧自由基，植株需要啟動并增強(qiáng)活性氧自由基的清除能力，以保證植株自身的正常生長（圖1、2、3）。同時，試驗(yàn)結(jié)果也表明晚熟品種‘隴薯3號’感染PVY或PLRV后植株SOD、CAT活性相對增量高于中早熟品種‘LK99’，而2個品種的POD活性在不同生育期表現(xiàn)并不一致；以SOD、POD活性相對增量分析兩個品種都表現(xiàn)為對PLRV 的應(yīng)激反應(yīng)比對PVY 強(qiáng)烈，因?yàn)橹仓旮腥綪LRV后SOD、POD活性相對增量比感染PVY后的要高，而以CAT活性分析結(jié)果呈現(xiàn)相反趨勢，綜合分析可能說明晚熟品種‘隴薯3 號’對PVY 或PLRV的反應(yīng)比中早熟品種‘LK99’敏感，植株對PLRV的應(yīng)激反應(yīng)比對PVY強(qiáng)烈（表3、4、5）。

MDA是植株細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用的重要指示物，可以用來反應(yīng)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度和植株抗應(yīng)激反應(yīng)的強(qiáng)度，MDA在植株的濃度可以表示植株細(xì)胞膜受到破壞的程度[23]。MDA含量表現(xiàn)為受到病毒感染的植株＞正常植株，可能表明馬鈴薯植株細(xì)胞膜受到了PVY或PLRV的破壞（圖4）；感染了PVY或PLRV的‘隴薯3號’植株葉片MDA含量相對增量明顯高于感染了PVY 或PLRV 的‘LK99’，感染了PLRV的‘隴薯3號’和‘LK99’植株葉片MDA含量相對增量均顯著高于感染了PVY 的‘隴薯3 號’和‘LK99’，這可能說明PVY 或PLRV 對晚熟品種‘隴薯3 號’細(xì)胞膜的破壞較中早熟品種‘LK99’嚴(yán)重，PLRV 對植株細(xì)胞膜的破壞比PVY 嚴(yán)重（表6）。在感染PVX 和煙草花葉病毒（TMV）的番茄植株中，也有葉綠素含量降低的報道[24,25]。黃瓜花葉病毒和番茄黃曲葉病毒，以及在許多其他被不同病毒感染的寄主植株中，葉綠素含量都表現(xiàn)出降低的趨勢[23,26-30]。葉綠素含量的變化是植株在滲透脅迫下的重要特征之一，Barut?ular 等[31]認(rèn)為葉綠素的變化是一個很好的指示植株滲透壓力的指標(biāo)。PVY或PLRV 感染馬鈴薯植株后，馬鈴薯植株葉片的葉綠體被破壞，葉綠素含量會明顯下降[32]。本研究也顯示了相同的趨勢（圖5）；感染了PVY和PLRV的‘隴薯3號’植株葉片總?cè)~綠素含量相對減量均顯著高于分別感染了PVY 和PLRV 的‘LK99’，感染了PLRV的‘隴薯3號’和‘LK99’植株葉片總?cè)~綠素含量相對減量均高于感染了PVY的‘隴薯3號’和‘LK99’（表7），試驗(yàn)結(jié)果可能說明PVY或PLRV對晚熟品種‘隴薯3號’的影響較中早熟品種‘LK99’嚴(yán)重，PLRV對植株的破壞比PVY嚴(yán)重。綜上所述，本研究結(jié)果可能表明感染了PVY或PLRV的馬鈴薯植株衰老速度明顯快于正常植株，PVY或PLRV均能夠顯著影響馬鈴薯植株的一些正常生理功能，從而導(dǎo)致馬鈴薯植株生長受到抑制，產(chǎn)量降低。從塊莖產(chǎn)量降低、有關(guān)保護(hù)酶（SOD、POD、CAT）活性增強(qiáng)、丙二醛含量升高、總?cè)~綠素含量減少的情況分析，晚熟品種‘隴薯3號’對PVY或PLRV的反應(yīng)比中早熟品種‘LK99’敏感，受到病毒的損害程度也比中早熟品種‘LK99’嚴(yán)重；同時以塊莖產(chǎn)量作為評價標(biāo)準(zhǔn)，也表明PVY對植株的損傷程度較PLRV嚴(yán)重。