龐鵬湘，郜 剛

（山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041000）

V 型ATP 酶（V-type ATPase，以下簡(jiǎn)稱V-ATP酶）主要存在于真核生物膜系統(tǒng)中，通過(guò)將氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)到囊泡或胞外，酸化細(xì)胞環(huán)境，以溶酶體和高爾基體2 種細(xì)胞器參與其內(nèi)吞途徑[1]，其利用ATP 水解的能量轉(zhuǎn)化為電化學(xué)勢(shì)能，進(jìn)而介導(dǎo)氫離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[2]。該酶在植物中的研究以擬南芥居多。在擬南芥中，至少有26 個(gè)基因編碼了全酶的12 個(gè)亞基[3]。研究發(fā)現(xiàn)該酶在擬南芥不同的部位所行使的功能具有很大的差異。如：V-ATP 酶C1 亞基在膨大的子葉、黃化幼苗下胚軸、根伸長(zhǎng)區(qū)中的表達(dá)，支持了V-ATP 酶在細(xì)胞體積增大中的作用；在根冠，V-ATP 酶影響根系的生長(zhǎng)以及對(duì)中度鹽脅迫的耐受性[4]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)ATP 酶B亞基可能參與擬南芥花粉萌發(fā)、花粉管生長(zhǎng)、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流動(dòng)和細(xì)胞應(yīng)急脅迫、質(zhì)子傳遞等生殖生物學(xué)過(guò)程[5]。在對(duì)蝴蝶蘭的研究中發(fā)現(xiàn)V-ATP酶E亞基在抵抗低溫脅迫中有重要作用。

在擬南芥中，V-ATP酶E亞基有3個(gè)亞型，各亞型間在功能上具有不同程度的特化，其中AtVHA-E1 是胚胎發(fā)育表達(dá)的主要亞型，而AtVHA-E2是花粉特異表達(dá)亞型，在配子體發(fā)育中具有專一性但又不是必需的，主要在發(fā)育種子的胚乳及周圍組織中表達(dá)的是AtVHA-E3亞基。對(duì)突變體研究表明，AtVHA-E3 能夠恢復(fù)AtVHA-El 缺失的表型，而AtVHA-E2卻不能。

目前，沒有太多的V-ATP 酶在馬鈴薯中的表達(dá)、功能等相關(guān)研究。有文章報(bào)道，在馬鈴薯中克隆一個(gè)V-ATP酶，使用對(duì)照和150 mmoL NaCl耐受性愈傷組織系的Tonoplast 富集囊泡作為模型系統(tǒng)來(lái)研究其活性以及參與液泡作為馬鈴薯耐鹽機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)液泡膜上的pH 梯度和Na+/H+反向物質(zhì)對(duì)鹽的響應(yīng)增加強(qiáng)烈，使得Na+隔離到液泡，在這個(gè)過(guò)程中V-ATP 酶發(fā)揮一定的催化作用，推論該酶有助于馬鈴薯耐鹽性的表現(xiàn)[4]。

利用分子生物學(xué)公用數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)基因的分子生物學(xué)特性、生化特性進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。本研究以馬鈴薯幼苗為材料，克隆了V型ATP 酶E 亞基基因的全長(zhǎng)，并對(duì)其序列進(jìn)行分析，為下一步驗(yàn)證馬鈴薯V-ATP 酶E 亞基基因的功能及在青枯菌脅迫中的分子調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 V型ATP酶E亞基基因的電子克隆

將實(shí)驗(yàn)室前期工作中獲得的一條受青枯菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的馬鈴薯（基因型為ED13）的EST序列，在NCBI 中運(yùn)行BLASTn 程序[6]。作為Query 的EST 與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中XM006352196.2 基因相似最高為98%。通過(guò)Bioedit軟件將序列拼接，直到不能延伸為止。

1.2 V型ATP酶E亞基基因編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

用在線服務(wù)器NCBI ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析核酸序列的開放閱讀框。通過(guò)NCBI Conserved domains（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測(cè)相關(guān)的V-ATP酶的保守結(jié)構(gòu)域；運(yùn)用ProtParam（http://www.expasy.org/cgi-bin/ProtParam.pl）和ProScale（http://www.expasy.org/cgi-bin/Protscale.pl）[7]進(jìn)行分析蛋白的分子量（Molecular weight）、等電點(diǎn)（Theoretical pI）、親水性平均系數(shù)（Grand average of hydropathicity，GRAVY）、不穩(wěn)定指數(shù)（Instability index）和脂溶指數(shù)（Aliphatic index）。CBS服務(wù)器的SignalP4.1 server 系統(tǒng)（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）用來(lái)分析信號(hào)肽[8]。利用WOLF（PSORThttps:/ /wolfpsort.hgc.jp/）和TargetP2.0 Serverr（http ://www. cbs. dtu. dk/services/TargetP/）分析蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位[9]。TMHMM Server 分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域[10]。NetPhos 2.0 Server（http:// www. cbs. dtu.dk/services/NetPhos/）分析蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)。PSIPRED analysis（http://bioin f.cs.ucl.ac.uk/psipr ed/）進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[11]，SWISS models（https://swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[12]。

1.3 V型ATP酶E亞基基因序列的進(jìn)化分析

進(jìn)入NCBI，輸入目標(biāo)基因的氨基酸序列，點(diǎn)擊BLAST進(jìn)行同源性分析，按照相似度由高到底的順序，選擇一定條數(shù)的序列依次下載，并使用MEGA 5.0軟件的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）用來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)樹，來(lái)進(jìn)行進(jìn)化地位分析[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 V型ATP酶E亞基基因序列

馬鈴薯V型ATP酶E亞基序列通過(guò)電子克隆獲得了一條堿基個(gè)數(shù)為1 257 的序列（圖1），通過(guò)ORF Finder分析核酸序列的開放閱讀框，得到這條序列的開放閱讀框堿基個(gè)數(shù)為726（126～852），以ATG為起始密碼子，以TAG為終止密碼子，編碼的蛋白質(zhì)個(gè)數(shù)為241。NCBI Conserved domains保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)，得到一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域vATP-synt_E，該家族包括液泡ATP合成酶E亞基以及古細(xì)菌ATP合成酶E亞基。

2.2 V型ATP酶E亞基基因編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

每種氨基酸都有特定的理化性質(zhì)，而整個(gè)蛋白質(zhì)的性質(zhì)則往往是其組成氨基酸性質(zhì)的加和。V型ATP酶E亞基蛋白在馬鈴薯基因組中blastp，有4條目標(biāo)基因，這4個(gè)基因染色體位置尚不明確，運(yùn)用ProtParam和ProScal進(jìn)行分析V型ATP酶E亞基蛋白理化性質(zhì)分析，蛋白的分子量（Molecular weight）是27 689.84 D、等電點(diǎn)（Theoretical pI）是7.28、不穩(wěn)定指數(shù)（Instability index）是44.06，該數(shù)值高于閾值40，為不穩(wěn)定蛋白，V型ATP酶E亞基蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白、半衰期在哺乳動(dòng)物的網(wǎng)織紅細(xì)胞中為30 h，在酵母細(xì)胞中大于20 h，在大腸桿菌體內(nèi)大于10 h、脂溶指數(shù)是增加球形蛋白熱穩(wěn)定性的一個(gè)積極因素，該蛋白的脂溶指數(shù)（Aliphatic index）是95.06、正電荷殘基數(shù)（Arg + Lys）和負(fù)電荷殘基數(shù)（Asp+Glu）各是38個(gè)。蛋白質(zhì)的種類、空間結(jié)構(gòu)及活性、功能都與肽鏈中氨基酸的種類及順序有關(guān)（表1），該蛋白由20種氨基酸組成，其中Glu（E）含量最高，為11.2%，其次Lys（K）、Leu（L），占9.1%；Thr（T）和Trp（W）含量最低，分別為0.8%、0.4%，親水性平均系數(shù)（Grand average of hydropathicity，GRAVY）是-0.551，該數(shù)值為負(fù)值則說(shuō)明該蛋白為親水性蛋白，在整個(gè)肽鏈當(dāng)中呈極不均勻分布（圖2）；疏水性氨基酸很明顯的少于親水性的氨基酸，并且親水性在第50～100個(gè)氨基酸區(qū)間較高；疏水性在第100～150個(gè)氨基酸區(qū)間比較高，所以V型ATP酶E亞基蛋白屬于親水性蛋白。

信號(hào)肽主要由疏水性氨基酸組成，運(yùn)用SignalP4.1 server進(jìn)行信號(hào)肽分析，預(yù)測(cè)結(jié)果為，該序列不存在信號(hào)肽，這與馬鈴薯V-ATP酶E亞基蛋白這一膜蛋白性質(zhì)相符合?；蚓幋a的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的分布與該蛋白的功能緊密相關(guān)，從而在一定程度上反映了該基因的功能。利用WOLF 和TargetP2.0 Serverr 分析蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，該蛋白細(xì)胞質(zhì)可能在細(xì)胞質(zhì)（Cyto）、葉綠體（Chlo）、細(xì)胞核（Nucl）、線粒體（Mito）和過(guò)氧化物酶體（Pero）中，主要分布在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中。蛋白質(zhì)序列含有跨膜區(qū)，可能作為膜受體起作用，也可能是定位與膜的錨定蛋白。將蛋白質(zhì)序列在TMHMM Serverv 2.0中檢索，預(yù)測(cè)其無(wú)跨膜區(qū)。NetPhos 2.0 Server進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)，其結(jié)果顯示，該氨基酸序列共10個(gè)磷酸化位點(diǎn)，8個(gè)Ser、1個(gè)Thr和1個(gè)Tyr。

了解蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)不僅有利于認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)的功能，也有利于認(rèn)識(shí)蛋白是如何執(zhí)行其功能的。SWISS model預(yù)測(cè)得到蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3），利用SWISS model預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)與模板之間的序列同源性為32.09%（V-typeproton ATPase subunit E，SMTL ID：3j9t.1P）。該蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)有α螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲4種形式。其中最主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)是α螺旋，共由168個(gè)氨基酸參與形成4段α螺旋區(qū)域，占全部氨基酸的69.71%；19個(gè)氨基酸參與形成延伸鏈，占全部氨基酸的7.88%；β轉(zhuǎn)角由9個(gè)氨基酸形成，占全部氨基酸的3.73%；45個(gè)氨基酸形成不規(guī)則卷曲，占比為18.67%。

表1 V型ATP酶E亞基蛋白的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of V-type ATPase E subunit protein

2.3 V型ATP酶E亞基基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹，可以研究生物進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程，概括各種生物之間的親緣關(guān)系。運(yùn)行MEGA 5.0軟件，將與該序列匹配度較高的20條序列輸入，構(gòu)建進(jìn)化樹（圖4）。從圖4中可以看出，馬鈴薯V-ATP 酶E 亞基與馬鈴薯E 亞基屬于同一分支，與煙草、煙草變種和潘那利番茄V-ATP酶E亞基的同源性也相對(duì)較高，而與木薯、巴西橡膠樹、蓖麻、可可、榴蓮屬、米莎草（芭蕉亞種）、蓮屬、金魚草等同源性較遠(yuǎn)。

3 討 論

從馬鈴薯中克隆了V-ATP酶E亞基基因的全長(zhǎng)序列，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，該序列沒有信號(hào)肽，具有多種功能保守域，編碼的蛋白質(zhì)為一親水性蛋白，具有水解酶活性，研究結(jié)果與其他生物V-ATPase E亞基的特征一致。

V-ATP酶在細(xì)胞內(nèi)參與多種生化反應(yīng)，例如含有與肌動(dòng)蛋白結(jié)合和位點(diǎn)，參與細(xì)胞骨架的形成以及細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)；具有調(diào)節(jié)hsp70活性的結(jié)構(gòu)域，預(yù)測(cè)具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的折疊、多肽在細(xì)胞器膜上的易位、協(xié)調(diào)對(duì)壓力的反應(yīng)，以及特定的蛋白質(zhì)降解有關(guān)；多種酶的催化活性，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)酸化的主要調(diào)節(jié)劑、參與物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[13,14]、參與到多種信號(hào)傳導(dǎo)的過(guò)程[15]，涉及多種脅迫生理調(diào)控[16,17]，過(guò)表達(dá)V-ATPase E 亞基的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物增強(qiáng)了對(duì)鹽和甘露醇耐受性[18]。其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。顯然，試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究V-ATPase E 亞基基因功能及在青枯菌脅迫下的響應(yīng)機(jī)制提供了依據(jù)。

V 型ATP 酶E 亞基蛋白位于KEGG 中，V-ATP 酶E 亞基參與的途徑分類范圍屬于生物特異性生物系統(tǒng)，包括吞噬、氧化磷酸化和代謝途徑。吞噬作用是通過(guò)細(xì)胞攝取相對(duì)大顆粒的過(guò)程，并且是組織重塑，炎癥和防御感染因子的中心機(jī)制。當(dāng)吞噬細(xì)胞表面上的特異性受體識(shí)別顆粒表面上的配體時(shí)，形成吞噬體。形成后，新生的吞噬體逐漸獲得消化特征。吞噬體的這種成熟涉及與其他膜細(xì)胞器的調(diào)節(jié)相互作用，包括再循環(huán)內(nèi)體，晚期內(nèi)體和溶酶體。吞噬體和溶酶體融合釋放出有毒產(chǎn)物，殺死大多數(shù)細(xì)菌并將其降解成碎片。表明V-ATPase E 亞基基因可能響應(yīng)青枯菌脅迫。

V-ATP 酶的分布廣泛且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對(duì)細(xì)胞的生理功能有著重要作用，研究表明V-ATP 酶的表達(dá)及相應(yīng)的調(diào)控有多種方式。V-ATP 酶的功能調(diào)控方式包括V1 和V02 個(gè)結(jié)構(gòu)域的解離和結(jié)合，內(nèi)部巰基的可逆氧化，激活劑和抑制劑的影響，靶標(biāo)膜的選擇幾個(gè)方面。V-ATP 酶的表達(dá)調(diào)控方式包括轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。其中，翻譯后修飾（PTM）是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的關(guān)鍵水平之一，其決定了真核細(xì)胞翻譯后蛋白質(zhì)的命運(yùn)，對(duì)疾病的診斷和預(yù)防有用，真核V-ATP 酶E功能可以通過(guò)催化V1 區(qū)和膜嵌入的V0 區(qū)的可逆解離來(lái)調(diào)節(jié)，具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。