吳林德,浙江省德清縣人民醫(yī)院超聲科 浙江省湖州市 313200

蒿業(yè)紅,徐珊珊,浙江蕭山醫(yī)院超聲科 浙江省杭州市 311200

方苑仲,杭州市余杭區(qū)婦幼保健院檢驗科 浙江省杭州市 311100

0 引言

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一種發(fā)病率較高的肝臟惡性腫瘤[1].HCC惡性生物學(xué)行為與其微血管新生狀態(tài)密切相關(guān),深入研究其微血管生成有著重要臨床意義[2].血管生成素樣蛋白4(angiopoietin like 4,ANGPTL4)作為一種血管生成素樣蛋白家族中的分泌型糖蛋白,其在促進(jìn)腫瘤血管生成、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)中發(fā)揮著重要作用[3],而目前其評估方法需采用具有創(chuàng)傷性的病理學(xué)檢查.本研究運用超聲造影(contrastenhanced ultrasound,CEUS)定量分析HCC的血流灌注參數(shù),探討其與ANGPTL4表達(dá)水平的相關(guān)性,旨在探討CEUS在評估活體HCC組織的ANGPTL4表達(dá)水平及血管生成中的價值.

1 材料和方法

1.1 材料 選擇2018-09/2019-12期間,在浙江蕭山醫(yī)院行手術(shù)切除的84例HCC患者作為研究對象.納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均病理證實為HCC;(2)術(shù)前均未曾行任何形式放化療及藥物治療;(3)無合并其它惡性腫瘤;(4)患者能配合CEUS檢查.其中男68例,女16例,年齡29-70歲,平均年齡50.83歲±11.02歲.病灶共計84個,直徑1.87-6.19 cm,平均直徑4.23 cm±1.10 cm.根據(jù)ANGPTL4表達(dá)結(jié)果分為：ANGPTL4陽性表達(dá)組,48例,男38例,女10例,年齡29-70歲,平均年齡51.53歲±10.47歲,直徑2.11-6.19 cm,平均直徑4.29 cm±1.09 cm,其中高分化12例、中分化10例、低分化26例;ANGPTL4陰性表達(dá)組,36例,男30例,女6例,年齡32-67歲,平均49.90歲±11.80歲,直徑1.87-5.53 cm,平均4.15 cm±1.12 cm,其中高分化9例、中分化8例、低分化19例.兩組間年齡(t=0.666,P=0.507)、性別(χ2=0.232,P=0.630)、直徑(t=0.568,P=0.571),病理分級(χ2=0.026,P=0.987)比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05).

1.2 方法

1.2.1 CEUS檢查：CEUS采用Acuson S2000超聲診斷儀,配有4C1探頭(頻率4.0 MHz),隨機(jī)配備對比脈沖系列成像技術(shù).造影劑采用聲諾維(sono Vue),按照說明書配備成混懸液.CEUS由一名高年資且經(jīng)驗豐富的超聲醫(yī)師進(jìn)行操作分析.首先對病灶進(jìn)行常規(guī)超聲檢查,明確腫瘤位置、大小、內(nèi)部回聲、邊界、血供等情況.啟動CEUS,經(jīng)肘部淺靜脈推注造影劑2.4 mL,同步計時,觀察并存儲造影全過程.選取病灶區(qū)域作為感興趣區(qū),繪制時間-強(qiáng)度曲線,獲得病灶的增強(qiáng)強(qiáng)度、達(dá)峰時間(圖1).

1.2.2 血管內(nèi)皮生長因子水平、ANGPTL4、微血管密度測定：ANGPTL4表達(dá)測定：術(shù)后組織標(biāo)本采用兔抗人ANGPTL4 多克隆抗體(美國Sigma公司),滴度為1：200,按照SABC法常規(guī)步驟行免疫組化.隨機(jī)選取每張切中的5個視野,根據(jù)視野中陽性細(xì)胞百分比評分：0分,陽性細(xì)胞＜5%;1分,5%-25%;2分,25%-50%;3分,≥50%.染色強(qiáng)弱評分：僅細(xì)胞核染藍(lán)色為陰性;胞核、胞漿以及胞膜染成棕黃色為陽性.0分,陰性;1分,弱陽性;2分,陽性;3分,強(qiáng)陽性.ANGPTL4 表達(dá)結(jié)果判定：兩項之和≤3分判定為陰性表達(dá);＞3分判定為陽性表達(dá).

微血管密度(microvessel density,MVD)測定：術(shù)后組織標(biāo)本經(jīng)甲醛固定,石蠟包埋切片,采用ElivisionTM兩步法免疫組化染色.參照Weidner等[4]的校正方法測定MVD.

血清血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平測定：清晨,空腹?fàn)顟B(tài),采集患者5 mL肘部靜脈血,3000 r/min離心15 min分離血清,-20 ℃冰箱存儲.按照酶聯(lián)免疫吸附試驗進(jìn)行操作,測定血清VEGF水平.

統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù).計量資料以mean±SD表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用方差分析;計數(shù)資料以(%)表示,組間比較采用χ2檢驗.相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析.P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 兩組間CEUS參數(shù)比較 ANGPTL4陽性表達(dá)組病灶的增強(qiáng)強(qiáng)度(enhancement intensity,EI)明顯高于ANGPTL4陰性表達(dá)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);ANGPTL4陽性表達(dá)組病灶的達(dá)峰時間(peak to time,TTP)明顯短于ANGPTL4陰性表達(dá)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(表1).高分化HCC的EI低于中分化HCC及低分化HCC,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);中分化HCC的EI低于低分化HCC,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);高分化HCC的TTP長于中分化HCC及低分化HCC,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);中分化HCC的TTP長于低分化HCC,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(表2).

2.2 兩組間ANGPTL4、VEGF、MVD水平比較ANGPTL4陽性表達(dá)組的ANGPTL4、MVD及VEGF水平明顯高于ANGPTL4陰性表達(dá)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(表3).高分化HCC的ANGPTL4、MVD及VEGF水平低于中分化HCC及低分化HCC,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);中分化HCC的ANGPTL4、MVD及VEGF水平低于低分化HCC,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(表4).

2.3 CEUS參數(shù)與ANGPTL4表達(dá)水平的相關(guān)性 HCC的EI與ANGPTL4表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.753,R2=567,P＜0.05),HCC的TTP與ANGPTL4表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.730,R2=0.532,P＜0.05)(圖2).

3 討論

HCC為富血供肝臟惡性腫瘤,其發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)與血管新生密切相關(guān)[5].血管新生是一系列在多因子調(diào)控作用下發(fā)生的有序而復(fù)雜的生物過程.因此,全面了解HCC血管新生狀態(tài)對于臨床制定治療方案,評估預(yù)后有著重要意義.

ANGPTL4作為一種血管生成素樣蛋白家族中的分泌型糖蛋白,不僅參與葡萄糖代謝以及脂質(zhì)代謝,而且在缺氧誘導(dǎo)因子作用下表達(dá)上調(diào),促進(jìn)腫瘤血管新生、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)以及細(xì)胞分化[6].MVD常被應(yīng)用于評估腫瘤的微小血管增殖狀態(tài),是目前臨床評估腫瘤血管生成的“金標(biāo)準(zhǔn)”,在惡性腫瘤中MVD數(shù)值越高,腫瘤侵襲能力越強(qiáng)、預(yù)后越差[7].VEGF 即是目前所知的特異性最高、作用最強(qiáng)的腫瘤血管生成正向調(diào)節(jié)因子.本研究結(jié)果中,ANGPTL4陽性表達(dá)組的ANGPTL4、MVD及VEGF水平明顯高于ANGPTL4陰性表達(dá)組(P＜0.05).證實了隨著HCC組織中ANGPTL4表達(dá)上調(diào),VEGF合成分泌增加,HCC微小血管生成能力增強(qiáng),促使HCC內(nèi)微血管大量增殖,為其提供生長發(fā)展所需的血供及營養(yǎng)物質(zhì).

表1 兩組間超聲造影參數(shù)比較

表2 不同病理分級肝細(xì)胞癌超聲造影參數(shù)比較

表3 兩組間血管內(nèi)皮生長因子、ANGPTL4、微血管密度水平比較

表4 不同病理分級肝細(xì)胞癌間血管內(nèi)皮生長因子、ANGPTL4、微血管密度水平比較

圖1 肝細(xì)胞癌的時間-強(qiáng)度曲線示意圖.

圖2 散點圖.A：增強(qiáng)強(qiáng)度與ANGPTL4表達(dá)水平;B：達(dá)峰時間與ANGPTL4表達(dá)水平.ANGPTL4：血管生成素樣蛋白4;EI：增強(qiáng)強(qiáng)度;TTP：達(dá)峰時間.

目前,臨床評估ANGPTL4表達(dá)率以及表達(dá)強(qiáng)度需通過獲取組織標(biāo)本行病理學(xué)檢查實現(xiàn).該方法存在創(chuàng)傷性、準(zhǔn)確取材依賴性等缺點,應(yīng)用受到一定限制.隨著超聲技術(shù)的不斷發(fā)展,CEUS為腫瘤微循環(huán)血流灌注檢測開辟了一條全新途徑.CEUS時所采用的新型造影劑Sono Vue不會滲透至細(xì)胞間隙,具有血池示蹤劑的藥代動力學(xué)特性[8].CEUS能通過時間-強(qiáng)度曲線定量分析目標(biāo)組織的血流動力學(xué)狀態(tài)變化.本研究結(jié)果中,ANGPTL4陽性表達(dá)組病灶的EI顯高于ANGPTL4陰性表達(dá)組(P＜0.05);而ANGPTL4陽性表達(dá)組的TTP明顯短于ANGPTL4陰性表達(dá)組.說明ANGPTL4陽性表達(dá)的HCC組織能在更短的時間內(nèi)獲得更充足的血流灌注量.原因可能是[9,10]：ANGPTL4陽性表達(dá)HCC組織通過ANGPTL4、VEGF的表達(dá)上調(diào)及分泌,誘導(dǎo)組織生成大量微小血管,使單位體積內(nèi)微小血管數(shù)量增多,血流灌注量增大,增強(qiáng)強(qiáng)度增大.同時,由于ANGPTL4陽性表達(dá)HCC組織內(nèi)存在的大量新生微小血管具有基底膜發(fā)育不全,血管平滑肌缺失、動靜脈短路等特點,使微小血管阻力進(jìn)一步下降,血流灌注速度增加,達(dá)峰時間縮短.本研究結(jié)果中,HCC的EI與ANGPTL4表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.753,P＜0.05),而TTP與ANGPTL4表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.730,P＜0.05).提示CEUS可在一定程度上反映ANGPTL4表達(dá)水平狀態(tài),即EI越大或TTP越短,ANGPTL4表達(dá)水平越高.

本研究結(jié)果顯示,高分化HCC的EI、ANGPTL4、MVD及VEGF水平低于中分化HCC及低分化HCC,且中分化HCC的EI、ANGPTL4、MVD及VEGF水平低于低分化HCC(P＜0.05),而高分化HCC的TTP長于中分化HCC及低分化HCC,且中分化HCC的TTP長于低分化HCC,(P＜0.05).提示隨著HCC惡性程度增加,其微小血管生成狀態(tài)越旺盛,其EI、ANGPTL4、MVD及VEGF水平呈上升趨勢,而TTP呈下降趨勢.證實了HCC惡性程度與其血管新生狀態(tài)密切相關(guān).

總之,HCC的CEUS灌注參數(shù)與ANGPTL4表達(dá)水平具有一定相關(guān)性,能無創(chuàng)性評估活體HCC組織的ANGPTL4表達(dá)水平情況,間接反映其血管新生狀態(tài).

文章亮點

實驗背景

準(zhǔn)確評估肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)組織的血管生成素樣蛋白4(angiopoietin like 4,ANGPTL4)表達(dá)水平,有助于臨床診治及預(yù)后評估.

實驗動機(jī)

運用超聲造影(contrast-enhanced ultrasound,CEUS)定量分析HCC的血流灌注參數(shù),探討其與ANGPTL4表達(dá)水平的相關(guān)性,以期為臨床評估活體HCC血管新生狀態(tài)提供參考.

實驗?zāi)繕?biāo)

本篇論文研究的主要目標(biāo)是探討HCC的血流灌注參數(shù)與ANGPTL4表達(dá)水平的相關(guān)性.結(jié)果顯示CEUS能客觀反映HCC微循環(huán)特點,其血流參數(shù)增強(qiáng)強(qiáng)度(enhancement intensity,EI)和達(dá)峰時間(peak to time,TTP)與ANGPTL4表達(dá)水平具有較好相關(guān)性,可間接反映HCC血管新生狀態(tài).

實驗方法

本篇論文為了達(dá)到目標(biāo)運用CEUS觀察HCC微循環(huán)血供特征.CEUS能實時顯示腫瘤組織的微循環(huán)血流灌注狀態(tài),從而間接反映其血管新生情況.

實驗結(jié)果

本篇論文研究達(dá)到了實驗?zāi)繕?biāo),研究結(jié)果顯示ANGPTL4陽性表達(dá)組病灶的EI、MVD、VEGF水平明顯高于ANGPTL4陰性表達(dá)組,而TTP明顯短于ANGPTL4陰性表達(dá)組(P＜0.05);HCC的EI與ANGPTL4表達(dá)水平呈正相關(guān),而TTP與ANGPTL4表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān).本研究結(jié)果說明CEUS能敏感反映HCC血流灌注狀態(tài),間接反映ANGPTL4表達(dá)情況,有助于臨床評估活體HCC的血管新生情況.

實驗結(jié)論

HCC的微循環(huán)血流狀態(tài)與ANGPTL4、MVD及VEGF水平密切相關(guān).CEUS作為一種無創(chuàng)性的微循環(huán)血流監(jiān)測手段,不僅有助于腫瘤良惡性質(zhì)的鑒別診斷,而且能動態(tài)觀察以及定量分析腫瘤的微循環(huán)灌注特征,間接反映腫瘤血管新生情況.本研究運用CEUS分析HCC微循環(huán)灌注特征,探討其與ANGPTL4表達(dá)水平的相關(guān)性,以期間接反映HCC血管新生情況.本研究通過實驗發(fā)現(xiàn),HCC的EI、TTP均與ANGPTL4表達(dá)水平具有良好相關(guān)性.證實了CEUS可用于無創(chuàng)性評估活體HCC的ANGPTL4表達(dá)水平,進(jìn)而間接評估活體HCC血管新生情況.

展望前景

HCC病灶位置較深時,不利于CEUS分析評估,而HCC病灶靠近膈頂或靠近胃腸道時,易受氣體干擾而影響CEUS評估.未來研究的方向為CEUS在HCC抗血管生成治療中的臨床應(yīng)用價值,最佳方法是運用動態(tài)三維CEUS分析HCC的微循環(huán)血流狀態(tài).