馬金剛 魏紅麗 尚恒

滄州市人民醫(yī)院體檢中心 061000

Graves病是臨床中常見的自身免疫性甲狀腺疾病，在遺傳、環(huán)境、感染等因素的影響下，甲狀腺內(nèi)自身免疫發(fā)生紊亂，導(dǎo)致抑制性T細(xì)胞功能降低，輔助性T細(xì)胞(Th)不適當(dāng)致敏，刺激B細(xì)胞產(chǎn)生促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)，從而導(dǎo)致甲狀腺功能亢進(jìn)癥的發(fā)生。因此，細(xì)胞免疫功能異常在Graves病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用[1]。

CD4+T細(xì)胞可分化為Th1、Th2、Th17、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(CD4+CD25+Foxp3+Treg，Treg細(xì)胞)等細(xì)胞亞群。Th1主要分泌腫瘤壞死因子、干擾素-γ等，介導(dǎo)細(xì)胞免疫；Th2主要分泌白細(xì)胞介素(IL)-4等，介導(dǎo)體液免疫；Treg細(xì)胞主要分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[2]。Th17是2005年首先被報道的一種新亞型，主要分泌IL-17A，在炎性反應(yīng)早期階段發(fā)揮促炎作用[3]。研究表明，Th各亞群之間的免疫失衡對Graves病的發(fā)生和發(fā)展有重要作用。Phenekos等[4]發(fā)現(xiàn)，在Graves病患者的外周血中存在Th1/Th2的免疫失衡，并向Th2方向偏移。而Th17和Treg細(xì)胞也參與了Graves病的發(fā)生與發(fā)展[5]。Th17和Treg細(xì)胞之間的動態(tài)平衡被破壞，自身免疫抑制功能下降可能是Graves病的發(fā)病原因[6]。

目前的研究多集中于Graves病患者外周血中Th1/Th2或者Th17/Treg細(xì)胞單一方面細(xì)胞免疫功能的變化，而關(guān)于Graves病患者外周血中Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞之間的相關(guān)性以及各T細(xì)胞亞群與甲狀腺功能及甲狀腺自身抗體之間相關(guān)性的研究很少。本研究擬分析Graves病患者外周血中T細(xì)胞亞群之間的相關(guān)性以及T細(xì)胞亞群與甲狀腺功能及甲狀腺自身抗體之間的相關(guān)性，為Graves病的發(fā)生與發(fā)展提供新的研究思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組 選取2017年12月—2018年6月于滄州市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科門診或住院初發(fā)未經(jīng)治療的Graves病患者65例(GD組)。其中男性18例，女性47例，年齡(30.28±6.53)歲，病程(7.62±2.93)個月；選取同期我院健康體檢者50名作為對照組，其中男性20名，女性30名，年齡(32.51±6.84)歲。兩組的性別、年齡等一般情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義。研究項目經(jīng)滄州市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 診斷及排除標(biāo)準(zhǔn) Graves病的診斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會內(nèi)分泌學(xué)分會2008 年頒布的《中國甲狀腺疾病診治指南》。排除標(biāo)準(zhǔn)：治療前存在白細(xì)胞減少、肝功能損害的患者；其他自身免疫性疾病以及近期使用免疫抑制劑或者皮質(zhì)類固醇者；亞臨床甲狀腺功能亢進(jìn)癥、妊娠、近期感染、各種惡性腫瘤、腎功能衰竭患者。

1.3 標(biāo)本采集及相關(guān)指標(biāo)檢測

1.3.1 標(biāo)本采集 所有初發(fā)Graves病患者均空腹抽取靜脈血，健康體檢者于體檢時抽取靜脈血。甲狀腺功能指標(biāo)包括：FT3、FT4、促甲狀腺激素(TSH)，檢測方法為電化學(xué)發(fā)光法，設(shè)備為羅氏e601，采用配套試劑盒；甲狀腺自身抗體包括：甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)、甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)、TRAb，檢測方法為免疫化學(xué)發(fā)光法，設(shè)備為美國Beckman coulter分析儀，采用配套試劑盒。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞 肝素抗凝靜脈血5 ml，行Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，懸浮于RPMI 1640培養(yǎng)液中。將PBMC懸液置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入佛波酯(美國Alexis公司)25 μg/L，伊諾霉素(美國Alexis公司)1 mg/L后，在37℃孵育箱中培養(yǎng)4 h，并收集細(xì)胞，加入PE-抗人CD4單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞表面染色(所有流式抗體均購自美國eBioscience公司)，分別加入FITC抗干擾素-γ、PE-抗IL-4、抗人CD25-APC、PE-抗人Foxp3單克隆抗體、PE-抗人IL-17A單克隆抗體和對照抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)因子染色，采用流式細(xì)胞儀檢測分析。用Cell Quest軟件獲取分析數(shù)據(jù)，以CD4+干擾素-γ+/CD4+T表示Th1占CD4+T細(xì)胞的比例，CD4+IL-4+/CD4+T表示Th2占CD4+T細(xì)胞的比例，以CD4+CD25+Foxp3+/CD4+T表示Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例。CD4+IL-17A+/CD4+T表示Th17占CD4+T細(xì)胞的比例。用CellQuest軟件獲取分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料及甲狀腺功能、甲狀腺自身抗體水平的比較 GD組年齡、性別構(gòu)成與對照組的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。與對照組相比，GD組FT3、FT4、TGAb、TPOAb和TRAb水平均顯著升高(P均<0.01)，TSH水平降低(P<0.01)，見表1。

2.2 兩組外周血中Th1、Th2、Th17 和Treg細(xì)胞的流式細(xì)胞分選結(jié)果 GD組中Th1、Th2、Th17在CD4+T細(xì)胞中的比例較對照組升高，GD組中Treg細(xì)

胞在CD4+T細(xì)胞中的比例較對照組降低，見圖1～4。

2.3 兩組外周血中Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞比例的比較 與對照組相比，GD組Th1、Th2、Th17在CD4+T細(xì)胞中的比例、Th1/Th2比值、Th17/Treg細(xì)胞比值均升高(P均<0.01)，Treg細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比例降低(P<0.01)，見表2。

2.4 兩組外周血中Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞比例之間的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析顯示，GD組Th1占CD4+T細(xì)胞的比例與Th17占CD4+T細(xì)胞的比例呈正相關(guān)(P=0.005)，其余T細(xì)胞亞群之間未發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)性，見表3、4。

2.5 GD組Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞百分比分別與FT3、FT4、TGAb、TPOAb、TRAb的相關(guān)性分析 GD組Th1占CD4+T細(xì)胞的比例與FT4、TPOAb水平呈正相關(guān)(P均<0.05)。Th2占CD4+T細(xì)胞的比例與TRAb水平呈正相關(guān)(P=0.002)，Th17占CD4+T細(xì)胞的比例與FT4、TPOAb水平呈正相關(guān)(P均<0.05)。Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例與FT3、FT4、TGAb、TPOAb、TRAb之間未發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)性，見表5。

3 討論

Graves病是臨床中常見的器官特異性自身免疫性疾病，Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡在Graves病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[7-8]。由于TRAb的刺激性作用導(dǎo)致了Graves病的發(fā)病，多數(shù)研究認(rèn)為Graves病以體液免疫為主，Th2在Graves病發(fā)病機(jī)制中起主要作用。而本研究顯示，GD組Th1、Th2占T細(xì)胞比例、Th1/Th2比值顯著高于對照組，提示Th1/Th2免疫失衡可能向Th1漂移。其原因可能是因為入組病例均為初發(fā)的Graves病患者，多數(shù)患者處于疾病發(fā)展的早期階段，提示Th1在Graves病的發(fā)病早期發(fā)揮了重要作用。Bossowski等[9]認(rèn)為，Graves病發(fā)病機(jī)制中以Treg細(xì)胞的免疫抑制功能降低為主，而本研究發(fā)現(xiàn)GD組Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例較對照組明顯下降，而Th17占CD4+T細(xì)胞的比例較對照組明顯升高，提示抑制性T細(xì)胞功能缺陷以及Th不適當(dāng)?shù)闹旅艟赡軈⑴c了Graves病的發(fā)病。

表1 對照組和GD組一般資料及血常規(guī)、甲狀腺功能、甲狀腺自身抗體水平的比較

注：GD組：Graves病組；TSH：促甲狀腺激素；TGAb：甲狀腺球蛋白抗體；TPOAb：甲狀腺過氧化物酶抗體；TRAb：促甲狀腺激素受體抗體

組別例數(shù)Th1(%)Th2(%)Th1/Th2比值Th17(%)Treg細(xì)胞(%)Th17/Treg細(xì)胞比值對照組5021.25±6.8911.47±4.012.09±1.021.44±0.327.40±2.710.23±0.11GD組6540.70±7.6615.69±5.402.94±1.203.10±0.603.29±1.021.06±0.45t值14.104.634.0217.71-11.2512.74P值0.000.000.000.000.000.00

注：GD組：Graves病組；Th：輔助性T細(xì)胞；Treg細(xì)胞：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

表3 對照組外周血中Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞比例之間的相關(guān)性分析

注：Th：輔助性T細(xì)胞；Treg細(xì)胞：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

表4 GD組外周血中Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞比例之間的相關(guān)性分析

注：Th：輔助性T細(xì)胞；Treg細(xì)胞：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

表5 GD組各指標(biāo)間相關(guān)性分析

注：Th：輔助性T細(xì)胞；Treg細(xì)胞：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；TSH：促甲狀腺激素；TGAb：甲狀腺球蛋白抗體；TPOAb：甲狀腺過氧化物酶抗體；TRAb：促甲狀腺激素受體抗體

Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞比例之間的相關(guān)性分析顯示，Th1占CD4+T細(xì)胞的比例與Th17占CD4+T細(xì)胞的比例呈正相關(guān)，而其余各T細(xì)胞亞群之間未發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)性。一方面，Th1分泌的干擾素-γ能增加Graves病患者甲狀腺組織主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ類抗原表達(dá)，摧毀甲狀腺自身免疫耐受，而由Th1所分泌的腫瘤壞死因子-α可直接造成甲狀腺濾泡細(xì)胞的破壞，二者共同介導(dǎo)促炎反應(yīng)，使疾病處于活動期[10]。另一方面，Th17具有很強(qiáng)的致炎功能，其分泌的細(xì)胞因子可引起炎性細(xì)胞對甲狀腺組織的浸潤以及對甲狀腺濾泡細(xì)胞的破壞，Th17與炎性反應(yīng)的活動度以及疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[11]。因此，Th1和Th17可能均參與了Graves病患者甲狀腺濾泡細(xì)胞的炎性反應(yīng)。而GD組Treg細(xì)胞比例下降，其免疫抑制功能降低，可能導(dǎo)致Th1、Th17不適當(dāng)?shù)闹旅簦せ铙w液免疫系統(tǒng)，使Th2產(chǎn)生TRAb，從而促進(jìn)Graves病的發(fā)生，但Th1與Th17所分泌細(xì)胞因子之間的相互作用有待進(jìn)一步研究。

Graves病患者外周血T細(xì)胞亞群比例與甲狀腺功能及甲狀腺自身抗體之間的相關(guān)性分析顯示，Th2占CD4+T細(xì)胞的比例與TRAb水平呈正相關(guān)，這可能與Th2介導(dǎo)體液免疫，產(chǎn)生TRAb有關(guān)。而Th1、Th17占CD4+T細(xì)胞的比例與FT4、TPOAb水平呈正相關(guān)。TPOAb是具有破壞性的抗體，通過補(bǔ)體發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，從而破壞甲狀腺濾泡細(xì)胞，其血液濃度與甲狀腺內(nèi)活動性炎性反應(yīng)關(guān)系密切，而TGAb、TRAb不具有破壞性作用[12]。因此，F(xiàn)T4、TPOAb水平可以反映Graves病患者甲狀腺濾泡細(xì)胞功能及炎性反應(yīng)，而促炎反應(yīng)是Th1、Th17參與Graves病發(fā)病的病理機(jī)制。綜上所述，Th1、Th17介導(dǎo)的促炎反應(yīng)參與了甲狀腺功能亢進(jìn)癥及免疫炎性反應(yīng)的發(fā)生。

因此，及時糾正Graves病患者的細(xì)胞免疫紊亂，降低Th1、Th17促炎反應(yīng)水平，能夠提高甲狀腺功能亢進(jìn)癥治療的時效性，從而為Graves病發(fā)病機(jī)制的研究和治療靶點的選擇提供理論基礎(chǔ)。