鄭天翔 王麗娟 任曉霞 楊生輝 羅光宏

(河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生態(tài)工程學(xué)院1，張掖 734000) (河西學(xué)院，甘肅省微藻技術(shù)創(chuàng)新中心2，張掖 734000) (甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室3，張掖 734000)

微藻油脂是一類重要的可再生資源，不僅可代替植物油脂，還是生物柴油的原料[1]。目前報道的產(chǎn)油微藻主要有葡萄藻和小球藻等[2]。小球藻(Chlorellavulgaris)是一種綠藻門小球藻屬單細(xì)胞綠藻，廣泛分布在世界范圍水系中，具有生長速度快、光合效率高、適應(yīng)性強等特點[3]。小球藻油中富含不飽和脂肪酸和多種功能性成分，可用于生產(chǎn)食品、餌料、飼料、高附加值的生物活性物質(zhì)和保健食品，亦是生產(chǎn)生物柴油的良好原料，具有非常廣闊的發(fā)展前景[4]。同時由于其生物量大、生長快、易培養(yǎng)、油脂積累多的特征，被認(rèn)為是最有工業(yè)化潛力的生物柴油原料。

小球藻細(xì)胞較小且細(xì)胞壁比較致密，油脂以脂質(zhì)體形式包裹在藻細(xì)胞內(nèi)。因此選擇細(xì)胞破壁方法和提取技術(shù)是油脂提取的關(guān)鍵所在。目前關(guān)于小球藻油脂的提取研究僅有幾篇報道，如林偉國等[5]采用水酶法破壁后正己烷-乙醇提取了小球藻油脂；鄧春芳等[6]利用溶藻菌對小球藻細(xì)胞破碎后正己烷提取油脂；周連寧等[7]采用甲醇-氯仿體系的加速溶劑萃取法對小球藻油脂進行了提取研究；李雅[8]采用了新型溶劑N-乙基正丁胺對小球藻油脂進行了提取研究；黃俊超等[9]采用乙醇石油醚對小球藻油脂進行了提取研究；龐庭才等[10]采用石油醚為提取試劑對小球藻油脂提取工藝進行優(yōu)化研究；劉憲夫等[11]比較了索氏提取和有機溶劑提取兩種方法對小球藻油脂提取的影響；Araujo等[12]比較了5種提取方法對小球藻油脂的提取效果，發(fā)現(xiàn)超聲波提取效率較高。上述研究中多集中于采用不同的破壁方法后提取總脂。而微藻油脂包括中性脂、糖脂和磷脂，其中糖脂和磷脂是細(xì)胞膜與細(xì)胞器膜的重要組成結(jié)構(gòu)，中性脂作為能量儲存物質(zhì)，才是生產(chǎn)生物柴油的理想原料。因此探討不同的提取試劑對中性脂的提取率和優(yōu)化提取工藝，并分析小球藻油脂脂肪酸的組成對微藻生物柴油的制備有重要意義。

本研究以小球藻為原料，采用超聲波輔助破壁，考察不同提取試劑對小球藻油脂和中性脂提取率的影響。以作為生物柴油的原料-中性脂為指標(biāo)對提取試劑進行篩選，并利用響應(yīng)面試驗優(yōu)化提取工藝，同時采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對小球藻油脂的脂肪酸成分進行分析。旨在尋找到一種油脂得率較高、可以制備生物柴油的油脂提取方法，為小球藻能源化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小球藻粉為蛋白核小球藻。

甲醇、乙醇、正己烷、三氯甲烷、丙酮、石油醚(60～90 ℃)、乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯溶液等均為分析純。十九烷酸甲酯購自美國Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 小球藻油脂的提取及其組分的測定

準(zhǔn)確稱取0.1 g小球藻粉于干燥的15 mL 試管中，加入適量提取試劑浸泡，超聲提取一定時間后10 500 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至已稱重的玻璃試管中，氮氣吹干后稱重得油脂重量。平行制備3份樣品，按公式計算小球藻油脂的提取率。

總脂分級：用硅膠柱(Agela Technologos:Cleanert silica-SPE; 500 mg)進行柱層析將總脂進一步分離。洗脫順序為: 氯仿洗脫中性脂(NL)，丙酮和甲醇洗脫糖脂(GL)，甲醇洗脫磷脂(PL)，然后將分離的組分用氮氣吹干至恒重[13]。

1.2.2 單因素試驗

取0.1 g小球藻藻粉于玻璃試管中，加入提取試劑浸泡，超聲功率250 W，超聲提取一定時間后離心，轉(zhuǎn)移上清液并恒質(zhì)量。固定其他因素，分別單因素考察單一提取試劑(乙醚、乙醇、正己烷、乙酸乙酯、石油醚、甲醇、丙酮、三氯甲烷和二氯甲烷)，混合提取試劑乙醇-石油醚(1∶1)、乙醚-石油醚(1∶1)、乙醇-正己烷(1∶1)、乙醇-正己烷(1∶2)和乙醇-正己烷(2∶1)，不同料液比(1∶40～1∶120 g/mL)，超聲時間(30～70 min)，浸泡時間(0.5～2.5 h)，超聲溫度(20～70 ℃)對小球藻油脂提取率的影響。

1.2.3 小球藻油的GC-MS分析

油脂甲酯化：加入2 mL含1%濃硫酸的甲醇，迅速混勻，于70 ℃水浴反應(yīng)30 min。冷卻至室溫后，加入2 mL正己烷和2 mL飽和氯化鈉，充分震蕩并靜置分層，加入50 μL內(nèi)標(biāo)十九烷酸甲酯，離心后取上層進行氣相色譜分析。GC條件如下：Thermo TR-35MS色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；柱溫100 ℃，保留2分鐘，以10 ℃/min速度升到250 ℃，保持3分鐘。進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度280 ℃，載氣為氦氣；進樣量0.5 μL，載氣流量 1 mL/min。MS條件：EI離子源，離子源溫度220 ℃，掃描范圍29～500 m/z。以面積歸一化法計算其相對含量。

1.2.4 小球藻掃描電鏡觀察

采用S-3700N掃描電子顯微鏡對未提取和提取后的小球藻樣品噴金處理后，觀察其表面結(jié)構(gòu)。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及處理

每組試驗設(shè)置3個平行，響應(yīng)面借助Design Expert 8.0.6軟件。并用Origin 9.1進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素考察試驗

2.1.1 單一提取試劑對油脂提取率的影響

分別加入甲醇、乙醇、正己烷、三氯甲烷、丙酮、石油醚、乙醚、二氯甲烷和乙酸乙酯，固液比為1∶100g/mL，浸泡1.5 h，超聲提取40 min，超聲溫度30 ℃。結(jié)果如圖1所示，三氯甲烷和甲醇提取率最高，二氯甲烷和乙酸乙酯次之，石油醚提取率最低。但三氯甲烷、甲醇和二氯甲烷提取的油脂顏色為深綠色，乙酸乙酯、乙醇和丙酮提取的油脂顏色為翠綠色，而正己烷、乙醚和石油醚提取的油脂顏色為淡黃色。提取油脂顏色偏綠可能是因為葉綠素含量較多。

注：1.三氯甲烷，2.甲醇，3.二氯甲烷，4.乙酸乙酯，5.乙醇，6.丙酮，7.正己烷，8.乙醚，9.石油醚。
圖1 單一提取試劑對小球藻油脂提取率的影響

2.1.2 混合提取試劑對油脂提取率的影響

分別加入乙醇石油醚(1∶1)、乙醚石油醚(1∶1)、乙醇正己烷(1∶1)、乙醇正己烷(1∶2)和乙醇正己烷(2∶1)的混合提取試劑，固液比1∶100(g/ml)，浸泡1.5 h，超聲提取40 min，超聲溫度30 ℃。結(jié)果如圖2所示，甲醇三氯甲烷(1∶2)提取率最高，甲醇正己烷(2∶1)次之，乙醇正己烷(1∶2)和乙醇石油醚(1∶1)提取率較低。

注：1.甲醇-三氯甲烷1∶2，2.甲醇-三氯甲烷1∶1，3.甲醇-三氯甲烷2∶1，4.甲醇-正己烷1∶2，5.甲醇-正己烷1∶1，6.甲醇-正己烷2∶1，7.乙醇-正己烷1∶2，8.乙醇-正己烷1∶1，9.乙醇-正己烷2∶1，10.乙醚-石油醚1∶2，11.乙醚-石油醚1∶1，12.乙醚-石油醚2∶1。
圖2 混合提取試劑對小球藻油脂提取率的影響

2.1.3 提取試劑對小球藻總脂組分含量變化的影響

選取提取率較高的2種單一溶劑和上述4種混合溶劑進行總脂分級，結(jié)果見圖3。由圖3可知，不同提取試劑提取的小球藻磷脂含量始終很高，而中性脂含量在乙醚-石油醚(1∶1)中最高，提取率為1.251%，占總脂的59%；乙醇正己烷(1∶2)次之，提取率為0.88%，占總脂的21.4%；而甲醇三氯甲烷(1∶2)、甲醇正己烷(2∶1)、三氯甲烷和甲醇提取率相差不大，在0.326%～0.395%之間。但由于乙醚易燃易爆，市面上不易獲得，故選擇中性脂提取率較高的乙醇正己烷(1∶2)為提取試劑。

注：1.三氯甲烷，2.甲醇，3.甲醇-三氯甲烷(1∶2)，4.甲醇-正己烷(2∶1)，5.乙醇-正己烷(1∶2)，6.乙醚-石油醚(1∶1)。
圖3 不同提取試劑對小球藻中性脂、磷脂和糖脂提取率的影響

2.1.4 料液比對油脂提取率的影響

在超聲時間40 min，超聲溫度30 ℃，浸泡1.5 h的條件下，分別以料液比1∶40、1∶60、1∶80、1∶100和1∶120進行試驗。結(jié)果如圖4所示，在料液比為1∶60 g/mL時小球藻油脂的提取率最高，料液比為1∶40時，可能由于溶劑較少，提取試劑不能完全浸入小球藻粉。當(dāng)料液比超過1∶60時，油脂基本被浸出，故選擇料液比為1∶60 g/mL。

2.1.5 超聲時間對油脂提取率的而影響

在料液比1∶60，超聲溫度30 ℃，浸泡1.5 h的條件下，分別以超聲時間30、40、50、60、70 min進行試驗。結(jié)果如圖4所示，隨著時間的增加，小球藻油脂的提取率逐漸升高，達到50 min時提取率最高，之后趨于穩(wěn)定，可能是在50 min時小球藻油脂提取已經(jīng)基本完成。因此，選擇超聲時間為50 min。

2.1.6 浸泡時間對油脂提取率的影響

在料液比1∶60，超聲溫度30 ℃，超聲時間50 min的條件下，分別以浸泡時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h進行試驗。結(jié)果如圖4所示。由于小球藻的細(xì)胞壁較厚且十分堅硬，浸泡一定時間有助于溶劑浸入細(xì)胞壁而提取完全。結(jié)果顯示隨著浸泡時間的增加小球藻油脂提取增加不顯著，考慮到降低后續(xù)處理時間，選擇時間為1 h。

2.1.7 超聲溫度對油脂提取率的影響

在料液比1∶60，超聲時間50 min，浸泡1.0 h的條件下，分別以超聲溫度20、30、40、50、60、70 ℃進行試驗。結(jié)果如圖4所示，隨著溫度的升高，小球藻油脂提取率逐漸升高，可能是溫度的升高增加了溶劑分子和油脂分子的動能而有利于油脂分子的擴散，當(dāng)達到60 ℃時趨于穩(wěn)定。因此選擇60 ℃為最佳超聲溫度。

圖4 料液比、超聲時間、浸泡時間和超聲溫度 對小球藻油脂提取率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析

采用Box-Behnken設(shè)計原理，以超聲溫度、超聲時間、料液比3個因子為自變量，小球藻油脂提取率為響應(yīng)值，進行三因素三水平的響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗，利用Design-Expert軟件進行數(shù)據(jù)的處理和分析。實驗設(shè)計方案和結(jié)果見表1。

表1 方案設(shè)計及響應(yīng)面法試驗結(jié)果

根據(jù)表1的結(jié)果，以油脂提取率為響應(yīng)值對數(shù)據(jù)進行多遠回歸擬合，得到關(guān)于提取溫度(A)、提取時間(B)和料液比(C)的二次多項式回歸方程：Y=7.47-8.75×10-3A-1.25×10-3B-0.043C-0.29AB-0.1AC-0.12BC-0.61A2-0.28B2-4×10-3C2

表2 回歸模型方差分析

根據(jù)回歸模型作出響應(yīng)面和等高線見圖5，表明超聲溫度和時間的交互作用對小球藻油脂提取率影響顯著，通過軟件分析，得到最佳提取工藝為提取溫度60.31 ℃、提取時間51.94 min、料液比1∶40，在此條件下油脂的提取率預(yù)測值為7.519 25%。

圖5 超聲溫度和時間的交互作用對油脂提取率 影響的等高線和響應(yīng)曲面圖

2.2.2 優(yōu)化提取工藝參數(shù)的驗證

為了驗證響應(yīng)面分析法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進行3次平行實驗。在實際提取過程中，將實驗條件適度調(diào)整為溫度60 ℃、提取時間52 min、料液比1∶40，實際測得的油脂提取率的平均值為7.54%。結(jié)果表明預(yù)測值與實際值之間有很好的擬合性，進一步證實了回歸模型的可靠性。

2.3 小球藻藻粉的掃描電鏡分析

將未處理和處理后的小球藻藻粉進行掃描電鏡觀察并進行比較，結(jié)果見圖6。由圖6可知，未經(jīng)處理的小球藻細(xì)胞由于之前經(jīng)過低溫干燥等一系列工藝使得藻粉表面凹凸不平，而超聲處理后的小球藻在視野內(nèi)大部分細(xì)胞發(fā)生了不同程度的變形和破壞，使得細(xì)胞壁破碎，體積變小?？梢姵曁幚砭哂休^好的破壁效果。

圖6 小球藻掃描電鏡圖

2.4 小球藻油脂脂肪酸甲酯GC/MS成分分析

通過Mainlib、replib譜庫檢索并參考相關(guān)文獻[14]，確定各個組分的結(jié)構(gòu)，用峰面積歸一法對各組分進行定量分析，結(jié)果見表3。表明小球藻油脂不飽和脂肪酸主要是中長鏈脂肪酸(C16-C20)，含量占總脂肪酸的48.07%。

表3 小球藻油脂肪酸甲酯GC/MS分析結(jié)果

3 討論

傳統(tǒng)的微藻油脂提取方法是基于極性溶劑-非極性溶劑的混合溶劑系統(tǒng)如氯仿-甲醇系統(tǒng)的Folch[15]法和Bligh-Dyer[16]法。這是由于藻細(xì)胞膜(細(xì)胞器膜)上的脂質(zhì)多為極性較大的磷脂糖脂等，而其胞內(nèi)脂大多為儲存能量的中性脂。極性溶劑溶解膜脂，提高藻細(xì)胞的通透性，利于非極性溶劑進入藻細(xì)胞溶解中性脂，從而增大油脂提取率。因此極性溶劑-非極性溶劑的混合溶劑系統(tǒng)不僅具有較好的細(xì)胞膜穿透能力和較合適的極性，并且可以保證中性脂的完全萃取。但從部分實驗結(jié)果來看，相比單一溶劑提取(三氯甲烷、甲醇)，混合溶劑的總油脂提取效果并沒有明顯提高，反而低于提取率最高的甲醇和三氯甲烷。這可能是不同溶劑提取出的小球藻油脂種類及成分存在差異。隨后對小球藻油脂分級發(fā)現(xiàn)，總脂提取率最高的單一溶劑甲醇、氯仿提取出的磷脂和糖脂最多，達到3.5%以上，中性脂僅為0.326%和0.381%；總脂提取率次之的甲醇氯仿、甲醇正己烷的混合溶劑提取出的磷脂和糖脂在2.6～2.8%之間，中性脂也僅為0.391%和0.357%；而乙醇-正己烷和乙醚-石油醚混合溶劑雖然總脂提取率較低，但中性脂提取率最高，分別為0.883%和1.25%。中性脂作為能量儲存物質(zhì)才是生物柴油的良好原料，糖脂和磷脂主要是色素和脂蛋白等雜質(zhì)。并且甲醇和氯仿被定性為中等毒性、麻醉性物質(zhì)，且氯仿被疑為可致癌物質(zhì)，其不僅能提取可皂化的油脂，還能提取不可皂化的油脂，如色素、脂蛋白以及其他脂質(zhì)和非脂質(zhì)的污染物[17]。因此有必要采用低毒性的醇類物質(zhì)(乙醇、異丙醇、丁醇)等、醚類物質(zhì)(甲基叔丁基醚)、烷烴類(己烷)物質(zhì)及這些溶劑的混合液來代替上述提取試劑。但由于乙醚易燃易爆，市面上不易獲得，因此本實驗選取乙醇-正己烷(1∶2)為提取試劑，該混合溶劑中性脂提取率較高，提取色素較少，比甲醇-氯仿更清潔，對人體傷害小，是一種綠色清潔試劑。此外混合溶劑中的乙醇是水溶性的醇，因此該提取試劑不僅可以提取干藻，也適合提取濕藻，更易于工業(yè)化。

龐庭才等[10]采用石油醚為提取試劑對小球藻油脂提取工藝進行優(yōu)化，最后得到料液比為1∶43 mL/g，超聲時間為62 min，超聲溫度為35 ℃時油脂提取率最高，達8.27%；周連寧等[7]采用新型加速溶劑萃取法對小球藻油脂提取工藝進行優(yōu)化，最后得到萃取溫度132.37 ℃，萃取時間12.79 min，氯仿甲醇體積比2.26∶1，萃取液體積60%時油脂提取率最高，達16.10%；而本研究優(yōu)化后小球藻油脂提取工藝為乙醇正己烷(1∶2)，料液比1∶40，超聲時間52 min，超聲溫度60 ℃，此條件下提取率7.54%，與文獻報道相比偏低，這可能與藻種培養(yǎng)方式和提取方法有關(guān)。由于不同培養(yǎng)方式以及培養(yǎng)條件得到的小球藻，其油脂種類及成分也存在差異。研究表明小球藻油脂提取率與藻種培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、起始pH值、起始氮濃度、不同碳源、氮源、以及不同培養(yǎng)基等[18]有關(guān)，并且培養(yǎng)方式如自養(yǎng)和異養(yǎng)也會對油脂含量產(chǎn)生較大差異。如李雅[8]研究發(fā)現(xiàn)異養(yǎng)-稀釋-光誘導(dǎo)小球藻后油脂提取率達到29.8%是自養(yǎng)的2倍。本研究中為了避免色素和其他雜質(zhì)干擾，選取了中性脂提取率較高的乙醇-正己烷混合試劑，因此造成總油脂提取率相比偏低；其次由于藻粉購自公司，主要是優(yōu)化藻油提取工藝而未對其前期培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，故油脂可能以其他形式如淀粉貯存于細(xì)胞中。但對于藻細(xì)胞中殘留的大量水溶性物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖和淀粉，后續(xù)可進行水溶性物質(zhì)的分離以及動物飼料的制備研究，提高小球藻的綜合利用從而降低制備生物柴油的成本。

生物柴油是由中長鏈脂肪酸甲酯(C14-C22)組成的[19]，作為理想的生物柴油替代品應(yīng)具有分子結(jié)構(gòu)為: 擁有較長的碳直鏈；雙鍵的數(shù)目盡可能少，最好只有一個雙鍵；含有一定量的氧元素；分子結(jié)構(gòu)盡可能沒有或只有很少的碳支鏈；分子中不含有芳香烴結(jié)構(gòu)[20]。本研究中檢測到小球藻中飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的含量分別為51.93%、1.6%和46.47%。生物柴油中不飽和雙鍵與其運動黏度、燃燒性能和冷濾點有關(guān)，不飽和度低的生物柴油，其碘值低，CN(十六烷值)值高，低溫性能差；而不飽和度高的生物柴油，則碘值高，CN值低，低溫性能優(yōu)異。碘值、CN值和低溫性能之間存在相互矛盾的關(guān)系。油脂中含大量的不飽和脂肪酸，制備出來的生物柴油比石化柴油更易受光、熱、金屬的催化以及水分等影響，從而發(fā)生變質(zhì)影響生物柴油存儲壽命和正常使用[21]。小球藻油脂中單不飽和以及多不飽和脂肪酸的分析，對其產(chǎn)油藻種的培養(yǎng)、育種和油脂提取等具有指導(dǎo)意義。同時也對后續(xù)制備生物柴油以及研究其性能指標(biāo)具有借鑒意義。

4 結(jié)論

采用超聲波輔助法提取小球藻中油脂，通過單因素試驗發(fā)現(xiàn)提取試劑為乙醇正己烷(1∶2)時油脂和中性脂提取率最高，并確定小球藻最優(yōu)浸泡時間為1 h。應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化小球藻油脂的提取工藝，結(jié)果表明，最佳提取工藝為：料液比1∶40，提取溫度60℃，提取時間52 min，在此條件下小球藻油脂的提取率達到7.54%。同時采用GC/MS對小球藻油脂中脂肪酸成分進行分析，發(fā)現(xiàn)小球藻中飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的含量分別為51.93%、1.6%和46.47%。本研究為小球藻中油脂的提取提供了可行性實驗參考。但由于有機溶劑的需求量較大，油脂提取成本較高，不適合工業(yè)化應(yīng)用，故有必要繼續(xù)研究其溶劑回收利用和藻渣中高附加值產(chǎn)物的綜合利用。從而有效降低成本緩解其工業(yè)化應(yīng)用壓力。