余金鳳 陳正啟 周 汐 吳素蕊 郭 相

云南變綠紅菇的遺傳多樣性與群體遺傳分化研究

余金鳳 陳正啟 周 汐 吳素蕊 郭 相*

（中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221）

以昆明、曲靖、楚雄、玉溪、昭通、臨滄、大理等7個(gè)變綠紅菇地理居群的30個(gè)子實(shí)體樣本為試驗(yàn)材料，基于ITS序列和LSU序列，對(duì)其分子變異、遺傳多樣性、群體遺傳分化進(jìn)行分析。結(jié)果：30個(gè)樣品中，基于ITS序列檢測(cè)到18個(gè)單倍型，基于LSU序列檢測(cè)到10個(gè)單倍型；基于ITS序列和LSU序列分別構(gòu)建的單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)及30個(gè)樣品的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，各地理居群的遺傳距離與地理距離之間沒(méi)有形成對(duì)應(yīng)關(guān)系，二者無(wú)明顯相關(guān)性?；趦蓚€(gè)序列的分析結(jié)果均顯示，各地理居群內(nèi)單倍型多樣性較豐富，而核苷酸多樣性低。表明變綠紅菇在不同的地理居群中的適應(yīng)能力強(qiáng)，遺傳多樣性較低，絕大部分遺傳分化來(lái)自于個(gè)體間的差異。

變綠紅菇；ITS；LSU；遺傳多樣性；群體遺傳分化

變綠紅菇（）又名青頭菌、綠菇，隸屬擔(dān)子菌亞門(mén)、層菌綱、紅菇目、紅菇科、紅菇屬，是云南常見(jiàn)野生菌之一，在全省各地州均有分布[1-5]。其富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖等營(yíng)養(yǎng)成分，味道鮮美，深受消費(fèi)者喜愛(ài)[3, 6-9]。近年來(lái)對(duì)變綠紅菇的研究多集中于化學(xué)成分、抗腫瘤抗氧化活性分析，菌種分離及分子鑒定等，對(duì)其遺傳多樣性和遺傳分化方面的研究較少。

遺傳多樣性通常指生物攜帶的遺傳信息總和。一個(gè)物種的多樣性是長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果，物種遺傳多樣性越高，遺傳變異越豐富，其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)力越強(qiáng)；反之，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)力越弱。精確評(píng)估物種的遺傳多樣性是物種保護(hù)的基礎(chǔ)，是確定優(yōu)先保護(hù)種、篩選優(yōu)良種質(zhì)的關(guān)鍵[10-13]。

本研究利用核糖體DNA 中的非編碼轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS（Internal Transcribed Spacer）序列[14-17]及28s核糖體大亞基LSU序列[18-21]作為DNA分子標(biāo)記，分析云南省7個(gè)地區(qū)變綠紅菇的遺傳多樣性及群體遺傳分化，探討地理分布對(duì)變綠紅菇遺傳特性的影響，為云南省變綠紅菇野生資源的保育和開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）供試菇體。30個(gè)變綠紅菇樣本分別采自云南昆明、曲靖、楚雄、玉溪、昭通、臨滄、大理（表1）。新鮮子實(shí)體采集后去除泥沙雜物，裝入干凈的自封袋中，并加入變色硅膠干燥。

表1 變綠紅菇樣本信息

（2）試劑。DNA PCR擴(kuò)增所有試劑均購(gòu)自TaKaRa 生物有限公司，分析用的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

（3）主要儀器設(shè)備。全自動(dòng)基因擴(kuò)增儀、高速冷凍離心機(jī)、Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀和核酸蛋白測(cè)定儀。

1.2 試驗(yàn)方法

（1）樣品預(yù)處理。將干燥后的變綠紅菇子實(shí)體表面雜物去除，取出部分子實(shí)體封裝于1.5 mL離心管中存儲(chǔ)備用。

（2）基因組DNA的提取。以干燥子實(shí)體為材料，采用基因組DNA快速提取試劑盒提取總基因組DNA。

（3）保守序列的擴(kuò)增及檢測(cè)。變綠紅菇ITS、LSU 基因序列的PCR 擴(kuò)增采用的特異性引物序列見(jiàn)表2。

表2 用于PCR擴(kuò)增的引物

PCR反應(yīng)采用50 μL反應(yīng)體系：TaKaRa Taq 0.5 μL，dNTP Mixture 4 μL，10×PCR Buffer 5 μL，10 μmol/L的上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 37.5 μL。設(shè)置以無(wú)菌水代替模板的陰性對(duì)照。

PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30次循環(huán)；再72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR結(jié)束后取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，觀察Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)結(jié)果。

（4）ITS和LSU片段的回收。檢測(cè)到PCR產(chǎn)物后，將剩下的產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，從瓊脂糖凝膠中切割下含有目的片段的凝膠，使用TIANGEN膠回收試劑盒進(jìn)行DNA的回收純化。

（5）篩選陽(yáng)性克隆。①將含有目的片段的膠回收產(chǎn)物與質(zhì)粒載體pMD19-T參照使用說(shuō)明進(jìn)行連接，連接體系為：膠回收產(chǎn)物（根據(jù)濃度而定）4.0 μL，pMD19-T 1.0 μL，2×Ligation I 5.0 μL，共10 μL，16 ℃連接30 min。②重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。③克隆子的初步篩選：挑取單菌落于含Amp的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)。④PCR驗(yàn)證：取培養(yǎng)的菌液為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，擴(kuò)增體系與程序設(shè)置同1.2（3）所述。

（6）測(cè)序。將PCR驗(yàn)證為陽(yáng)性克隆的菌液送昆明碩擎生物科技有限公司測(cè)序。

1.3 序列處理

將已測(cè)得的目的片段序列和從GenBank中通過(guò)BLAST檢索獲得的參考序列進(jìn)行多重對(duì)位排列，并手動(dòng)去除排列結(jié)果兩端的非對(duì)位排列區(qū)。

1.4 序列變異情況

用MEGA（Version5.1）軟件計(jì)算變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、單一變異位點(diǎn)、轉(zhuǎn)換/顛換位點(diǎn)數(shù)比。

1.5 遺傳多樣性及遺傳變異分析

用Arlequin3.5軟件統(tǒng)計(jì)各地理居群樣品的單倍型多樣性、核苷酸多樣性、核苷酸平均差異數(shù)、計(jì)算不同地理居群間的群體遺傳差異指數(shù)，分析各地理居群的遺傳變異情況。DnaSP5軟件計(jì)算群體的核苷酸平均差異數(shù)及核苷酸歧義度，評(píng)估各地理居群的遺傳多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列及LSU序列的變異情況

本研究獲得變綠紅菇樣本的ITS序列和LSU序列各30個(gè)，經(jīng)處理去掉兩端側(cè)翼序列后ITS序列長(zhǎng)度為697 bp，多態(tài)位點(diǎn)24個(gè)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)5個(gè)，單一變異位點(diǎn)19個(gè)。4種堿基組成分別為：A=23.59%，T=27.71%，G=25.38%，C=23.33%，A+T含量（0.513）略高于G+C（0.487），轉(zhuǎn)換/顛換R值為3.01。LSU序列長(zhǎng)度為761 bp，多態(tài)位點(diǎn)10個(gè)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)4個(gè)，單一變異位點(diǎn)6個(gè)。4種堿基組成分別為：A=22.65%，T=24.11%，G=31.17%，C=22.06%，A+T含量（0.468）低于G+C（0.532），轉(zhuǎn)換/顛換R值為2。兩個(gè)片段的測(cè)序統(tǒng)計(jì)結(jié)果均說(shuō)明絕大部分核苷酸的替換方式為轉(zhuǎn)換，都驗(yàn)證了親緣關(guān)系近的分類階元之間的替換主要以轉(zhuǎn)換為主[22]。

2.2 基于ITS序列的群體遺傳多樣性及遺傳變異分析

根據(jù)ITS分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，對(duì)變綠紅菇不同地理居群的遺傳多樣性的分析結(jié)果（表3）：7個(gè)地理居群的30個(gè)變綠紅菇個(gè)體樣品，共檢測(cè)到單倍型18個(gè)。樣品共享單倍型情況如表4所示。在物種水平上單倍型多樣性（Hd）為0.949±0.021，核苷酸多樣性（Pi）為0.003 69±0.000 045?？梢?jiàn)單倍型多樣性高而核苷酸多樣性低，表明變綠紅菇在不同的環(huán)境下有相應(yīng)的適應(yīng)對(duì)策，生存能力較強(qiáng)。

用NJ法構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）。聯(lián)系圖1和表4結(jié)果可以看出，各單倍型并未按地理分布在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上聚集到一起，支持率較低。說(shuō)明單倍型之間的差異較小，不能形成可靠分支。且各地理居群是由多個(gè)單倍型組成，分屬于不同地理居群的個(gè)體可共享一個(gè)單倍型。說(shuō)明各地理居群間存在基因交流，遺傳分化較小。說(shuō)明不同地區(qū)的樣品之間差異較小，相似度較高。

對(duì)不同地理居群間的Fst值統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表5）顯示，F(xiàn)st值的變化范圍為0.023 06～0.186 05。其中，昆明和大理群體分化較小，F(xiàn)st值為0.023 06；大理和臨滄群體分化較大，F(xiàn)st值為0.186 05。此外，昭通與其他6個(gè)地理居群間的Fst值均≤0，說(shuō)明其與各群體間基因交流頻繁，無(wú)分化；楚雄除與大理群體之間存在很小程度的分化外，與其他各地理居群間均無(wú)分化；玉溪與曲靖群體間也無(wú)分化。由表6可知，不同地理居群間核苷酸差異數(shù)Kxy變化范圍為1.781 82～4.250 00，核苷酸歧義度Dxy范圍為0.002 58～0.006 16，大理和曲靖與其他群體差異較大。說(shuō)明這兩個(gè)群體相對(duì)于其他群體變異較大，遺傳距離較遠(yuǎn)。

2.3 基于LSU序列的群體遺傳多樣性及遺傳變異分析

表3 基于ITS序列變綠紅菇不同地理居群的遺傳多樣性

表4 基于ITS序列的變綠紅菇單倍型及共享單倍型樣本信息

圖1 基于ITS序列構(gòu)建的變綠紅菇單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

依據(jù)LSU分子數(shù)據(jù)，對(duì)變綠紅菇不同地理居群的遺傳多樣性的分析結(jié)果（表7）：7個(gè)地理居群的30個(gè)變綠紅菇個(gè)體樣品中，共檢測(cè)到10個(gè)單倍型。樣品共享單倍型情況如表8所示，在物種水平上單倍型多樣性（Hd）為0.710±0.087，核苷酸多樣性（Pi）為0.001 58±0.000 37。

用NJ法構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）。聯(lián)系樹(shù)形和表8的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，各單倍型并未按地理分布在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上聚集到一起，支持率較低。說(shuō)明單倍型之間的差異較小，不能形成可靠分支。各地理居群是由多個(gè)單倍型組成，而分屬于不同地理居群的個(gè)體可共享一個(gè)單倍型。說(shuō)明各地理居群間存在基因交流，遺傳分化較小。說(shuō)明不同地區(qū)的樣品之間差異較小，相似度較高。該結(jié)果與ITS序列的分析結(jié)果吻合。

不同地理居群間的Fst值范圍為0.016 22～0.055 56（表9）；大理和昭通、曲靖和大理群體分化較大，F(xiàn)st值為0.055 56。楚雄除與大理群體之間存在很小程度的分化外，與其他各地理居群間均交流頻繁，無(wú)分化；曲靖與昭通、臨滄兩個(gè)群體間的Fst值均為0，說(shuō)明其間基因交流頻繁，無(wú)分化；臨滄與曲靖、昭通兩群體間，大理與玉溪、臨滄兩群體間也無(wú)分化。不同地理居群間核苷酸差異數(shù)Kxy變化范圍為0～2.300 00，核苷酸歧義度Dxy范圍為0～0.003 04（表10），大理和玉溪與其他群體差異較大，說(shuō)明這兩個(gè)群體相對(duì)于其他群體變異較大，遺傳距離較遠(yuǎn)。

表5 基于ITS序列的不同地理居群間的Fst值

注：Fst＜0.05，表示群體間幾乎沒(méi)有遺傳分化； 0.05≤Fst＜0.15，表示分化程度較低；0.15≤Fst＜0.25，為中度分化；Fst≥0.25，表明分化程度較高[23-26]，表9同。

表6 基于ITS序列的不同地理居群間核苷酸平均差異數(shù)（Kxy，上三角）和核苷酸歧義度（Dxy，下三角）

表7 基于LSU序列的變綠紅菇不同地理居群的遺傳多樣性指數(shù)

表8 基于LSU序列的變綠紅菇單倍型及共享單倍型樣本信息

圖2 基于LSU序列構(gòu)建的變綠紅菇單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表9 基于LSU序列的不同地理居群間的Fst值

表10 基于LSU序列不同地理居群間的核苷酸平均差異數(shù)（Kxy，上三角）和核苷酸歧義度（Dxy，下三角）

3 討 論

本研究基于云南7個(gè)地區(qū)野生變綠紅菇的ITS序列及LSU序列信息，研究不同地理居群變綠紅菇的遺傳變異，統(tǒng)計(jì)其單倍型數(shù)并構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，解析了云南部分地區(qū)變綠紅菇群體的單倍型多樣性及遺傳多樣性。

基于ITS序列的研究結(jié)果表明，單倍型Hap-1、Hap-4、Hap-6出現(xiàn)的頻率較高（13.3%），而單倍型Hap-2、Hap-3、Hap-5、Hap-7、Hap-8、Hap-10、Hap-12～18均為獨(dú)享單倍型，說(shuō)明變綠紅菇單倍型多樣性較高。各地理居群的遺傳多樣性指數(shù)變化不大。曲靖群體單倍型多樣性和核苷酸多樣性明顯高于其他群體，群體遺傳多樣性較高；玉溪群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性則明顯低于其他群體，遺傳多樣性低。從單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)看，各進(jìn)化分支之間的分歧度很低，沒(méi)有形成明顯的聚類分支，單倍型分布與地理居群分布之間沒(méi)有明顯的對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)關(guān)系。同一物種不同群體間的遺傳分化程度可以用遺傳分化指數(shù)Fst來(lái)判別，以衡量群體間的遺傳距離。本研究遺傳分化結(jié)果顯示，各群體間存在著較低程度的遺傳分化[27]。

基于LSU序列的研究結(jié)果，30個(gè)樣品中檢測(cè)到10個(gè)單倍型，低于ITS序列檢測(cè)結(jié)果的18個(gè)，這可能是由于LSU序列更加保守，產(chǎn)生突變和新單倍型的概率更低。10個(gè)單倍型Hap-2出現(xiàn)頻率最高（53.3%），其可能是變綠紅菇群體的祖先單倍型，是在種群中穩(wěn)定存在、適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)單倍型。從遺傳多樣性指數(shù)可知，曲靖和昭通的單倍型多樣性為0，可能與用于實(shí)驗(yàn)的樣本數(shù)太少有關(guān)。但與ITS序列的分析結(jié)果相比，其總體上的遺傳多樣性是低的。遺傳分化指數(shù)結(jié)果與ITS序列的分析結(jié)果一致，同樣表明群體間遺傳分化較低。

綜合兩個(gè)序列片段的數(shù)據(jù)分析結(jié)果，云南地區(qū)變綠紅菇群體整體上表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性。各地理居群?jiǎn)伪缎投鄻有暂^高，核苷酸多樣性較低，說(shuō)明變綠紅菇在不同地理居群中的適應(yīng)能力強(qiáng)，但遺傳分化程度低，絕大多數(shù)分化來(lái)自于個(gè)體間的差異，可能原因是變綠紅菇傳播歷史較短，沒(méi)有積累過(guò)多的遺傳變異。

變綠紅菇作為云南省普遍食用的野生菌，具有顯著的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，深入了解變綠紅菇的遺傳多樣性，了解其遺傳分化現(xiàn)狀，對(duì)于后期有針對(duì)性地開(kāi)展資源保護(hù)培育及綜合開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。本研究使用ITS標(biāo)記和LSU標(biāo)記評(píng)估云南變綠紅菇的遺傳多樣性和遺傳分化情況，獲得了多態(tài)位點(diǎn)和關(guān)鍵的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)信息。在未來(lái)的研究中，需不斷增加不同地理居群樣本數(shù)量，使樣品數(shù)能完全囊括云南各地區(qū)，再配合多種類型的分子標(biāo)記，精確評(píng)估物種遺傳多樣性，為后續(xù)研發(fā)提供詳實(shí)的數(shù)據(jù)支撐。

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Genetic variation and population genetic differentiation ofin Yunnan

Yu Jinfeng Chen Zhengqi Zhou Xi Wu Surui Guo Xiang*

（Kunming Edible Fungi Institute, All China Federation of Supply and Marketing Cooperatives, Kunming,Yunnan 650221, China）

In order to find out the genetic diversity and differentiation ofpopulation distributed in different areas of Yunnan.The fruiting bodies offrom 7 geographical populations, namely Kunming (KM), Qujing (QJ), Chuxiong (CX), Yuxi (YX), Zhaotong (ZT), Lincang (LC) And Dali (DL), were used as test materials. Molecular variation, genetic diversity and population genetic differentiation of 30 samples were analyzed based on ITS and LSU sequences. The results showed that 18 haplotypes were detected based on ITS sequence and 10 haplotypes were detected based on LSU sequence. The haplotype phylogenetic tree constructed based on ITS sequence and LSU sequence showed that there was no corresponding relationship between genetic distance and geographical distance in each geographical population, and there was no significant correlation between them. The results of the two sequences analysis showed that the haplotype diversity was rich in each geographic population, while the nucleotide diversity was low, indicating that the genetic diversity ofwas low; Fst values among different geographical populations were basically less than 0.15, indicating that the degree of genetic differentiation was low, and most of the differentiation came from differences among individuals.

; ITS; LSU; genetic variation; population genetic differentiation

S646

A

2095-0934（2020）03-178-07

云南省技術(shù)創(chuàng)新人才項(xiàng)目（2017HB094）

余金鳳（1988—），女，碩士，助理研究員，主要從事食用菌分子生物學(xué)研究。E-mail：584905471@qq.com。

郭相（1980—），男，碩士，副研究員，主要從事珍稀野生食用菌持續(xù)利用技術(shù)研究。E-mail：guoxkm@yeah.net。