高 原， 陳 川， 王 晶

(中國計量科學研究院，北京100029)

1 引 言

目前2019冠狀病毒病(COVID-19)在全球范圍爆發(fā)，這是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)入侵人體引起的一種急性呼吸道傳染病。SARS-CoV-2是目前發(fā)現(xiàn)的第7種可以感染人的冠狀病毒，其余6種為人冠狀病毒229(HCoV-229)、人冠狀病毒NL63(HCoV-NL63)、人冠狀病毒OC43(HCoV-OC43)、人冠狀病毒HKU1(HCoV-HKU1)、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)[1]。

針對COVID-19的診斷，首先主要集中于病毒核酸的檢測，即基于聚合酶鏈反應(PCR)的核酸檢測，已成為SARS-CoV-2檢測的金標準[2,3]。病毒核酸檢測過程對實驗室環(huán)境、檢測人員、儀器要求比較高；并且通常需要對鼻拭子、咽拭子、肛門拭子進行采樣[4]，采樣人員在操作過程中需嚴格控制感染風險。目前疑似病例數(shù)量較多，如果只靠病毒核酸檢測來進行診斷，其工作量太大；并且由于樣本采集手法、樣本保存條件、PCR操作過程等因素，可能導致假陰性和假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。增加SARS-CoV-2抗體、抗原檢測的方法來進行輔助診斷，與核酸檢測手段相互補充，可彌補核酸檢測時出現(xiàn)的假陰性和假陽性，以提高疑似病例檢測的準確率。

目前許多企業(yè)相繼推出了基于免疫學診斷的新冠病毒抗體檢測和抗原檢測試劑盒，抗體檢測試劑盒居多。中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會《新型冠狀病毒肺炎診療方案(第7版)》中增加了通過檢測新冠病毒蛋白特異性抗體檢測來輔助新冠肺炎的臨床診斷。

本文將對新冠病毒抗體檢測和抗原檢測的免疫分析方法重點進行分析。

2 免疫反應

新型冠狀病毒入侵人體后，病毒本身攜帶的蛋白具有抗原活性，會刺激人體免疫細胞產(chǎn)生的抗體來抵抗病毒，先是抗體免疫球蛋白M(IgM)，然后會是抗體免疫球蛋白G(IgG)等。通過免疫分析技術可以檢測人體內(nèi)是否存在病毒攜帶的蛋白(抗原)和由于病毒入侵產(chǎn)生的抗體。

2.1 抗體檢測

在病毒入侵人體后，其相應的抗原決定簇與淋巴細胞接觸將誘導淋巴細胞分泌產(chǎn)生特異性抗體，包括5類免疫球蛋白，分別為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。

抗體檢測則是通過特定的抗原與待檢樣品中產(chǎn)生的抗體發(fā)生免疫反應從而實現(xiàn)對樣品中的抗體進行檢測?；颊弑桓腥静《竞螽a(chǎn)生免疫反應，會產(chǎn)生抗體。相關研究表明，通過對患者血液中IgM和IgG的表達水平進行檢測，可以對COVID-19進行診斷[5,6]。檢測包括了對血液中IgM和IgG單獨檢測和對兩者進行聯(lián)合檢測[7]。與核酸檢測相比，抗體檢測更適用于對新冠病毒核酸檢測呈陰性的疑似病例進行補充檢測。抗體檢測結(jié)果可幫助識別患者的感染情況：早期感染，IgM抗體呈現(xiàn)陽性；當感染有一段時間，如超過7 d(或既往感染)，IgG抗體顯現(xiàn)陽性，一定時間范圍內(nèi)，其持續(xù)時間越長含量越高[7,8]。

獲得可以識別抗體的抗原或抗抗體是抗體檢測的關鍵，通常使用重組蛋白技術。Zhang等[9]用2019-nCoV包膜蛋白E和核衣殼蛋白N作為抗原來對血清中IgM和IgG進行免疫分析。由于冠狀病毒的核衣殼蛋白(NPs)具有高度的同源性， Zhou等[5]成功使用蝙蝠SARSr-CoV Rp3核衣殼蛋白(NP)作為抗原，通過酶聯(lián)免疫吸附技術對患者的IgG和IgM抗體進行檢測。Cai等[10]則從GenBank(NC_045512.1)基因組序列中推斷合成出20種肽被作為候選抗原，再通過免疫分析從中選擇合適的肽段，用于新冠病毒抗體檢測。重組抗原技術相對于抗體制備更容易，所以抗體檢測方法研發(fā)周期相對更短。

2.2 抗原檢測

抗原檢測是基于抗體與樣本中病毒攜帶的蛋白質(zhì)產(chǎn)生免疫反應，通過對感染部位的取樣進行免疫分析從而對COVID-19進行判斷。抗原檢測的關鍵是制備適用于抗原檢測的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體。大多數(shù)抗體必須利用免疫動物產(chǎn)生免疫反應獲得，制備過程相對繁瑣耗時。

新型冠狀病毒是屬于冠狀病毒科的單條正鏈RNA病毒，同其他冠狀病毒一樣，SARS-CoV-2包含了核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein，N)、刺突糖蛋白(Spike protein，S)、包膜蛋白(Envelope protein，E)和膜蛋白(Membrane protein，M)[1,11]。S蛋白是該病毒入侵人體細胞的關鍵，通過S蛋白上的受體結(jié)合域(RBD)與宿主細胞的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)產(chǎn)生特異性結(jié)合，從而介導病毒進入宿主細胞[12]。Lei等[13]將ACE2的變體與人免疫球蛋白G進行重組，所得到的融合蛋白可以與SARS-CoV-2結(jié)合。

SARS-CoV-2與SARS-CoV的S蛋白上的受體結(jié)合域具有相對較高的同源性，有研究發(fā)現(xiàn)抗SARS-CoV人單克隆抗體CR3022可以與SARS-CoV-2有效結(jié)合[14]。

可以與SARS-CoV-2有效結(jié)合的蛋白，具有被應用于抗原檢測的潛力，對特異性抗體的制備具有非常重要的意義。此外，SARS-CoV-2的核衣殼蛋白(NPs)在所有7種冠狀病毒之間有非常高的同源性共享。Li 等[11]通過已報道的NP序列，利用小鼠和新西蘭兔制備了相應的單克隆抗體和多克隆抗體，用于SARS-CoV-2的抗原檢測。

2.3 抗體和抗原檢測試劑盒

不少企業(yè)相繼推出了基于免疫學分析的SARS-CoV-2抗原抗體檢測試劑盒，使用試劑盒可以使檢測過程更加簡便、快速、標準化?？乖贵w檢測試劑盒包括了IgG抗體檢測試劑盒、IgM抗體檢測試劑盒、IgG/IgM聯(lián)合抗體檢測試劑盒以及抗原檢測試劑盒。

IgM與IgG的檢測有助于對病毒感染階段進行判斷。研究發(fā)現(xiàn)測量IgG和IgM總抗體量具有比單獨測量單種抗體的測量結(jié)果具有更高的陽性率，減少了檢測過程中假陰性的概率[7]，IgM、IgG檢測可以顯示病毒感染的不同階段。而抗原試劑盒直接對感染部位病毒蛋白進行檢測，不同種類的試劑盒的檢測結(jié)果可提供不同階段的有效信息。

截至2020年3月31日，中國國家藥品監(jiān)督管理局應急審批新冠病毒檢測試劑產(chǎn)品25個，其中抗體檢測試劑盒8個。

3 免疫分析方法

不同廠家生產(chǎn)的抗體檢測和抗原檢測試劑盒用到的免疫分析方法不盡相同，有酶聯(lián)免疫吸附技術、膠體金免疫技術、熒光免疫層析技術和磁微?；瘜W發(fā)光技術等。不同的分析方法可能用到不同的免疫分析方法、測量技術，從而造成檢測性能有所差別。

3.1 酶聯(lián)免疫吸附技術

酶聯(lián)免疫吸附技術是最常用的一種免疫分析方法，將酶催化反應與免疫反應結(jié)合，包括了雙抗夾心法、兩位點一步法、間接法測抗體、競爭法、捕獲法；其原理是將酶分子與抗體(抗原)分子共價結(jié)合，然后將酶標記的復合物與吸附在固相載體上的抗原或抗體接觸反應，發(fā)生特異性結(jié)合，最后加入酶的反應底物，根據(jù)底物的顏色反應進行定性和定量分析；其檢查結(jié)果可通過肉眼觀察顏色或使用酶標儀進行吸光度測量來判斷。SARS-CoV-2抗原抗體檢測主要用到雙抗原(體)夾心法、間接法和捕獲法[5,8,15]。

雙抗原夾心法進行抗體檢測時，使用含有SARS-CoV-2的S蛋白的受體結(jié)合域的哺乳動物細胞表達的重組抗原與過氧化物(HRP)偶聯(lián)，用于和樣本中的目標抗體結(jié)合，然后再與和固定相連接的抗原結(jié)合，最后在反應體系中加入酶催化底物，底物的顏色反應作為檢測結(jié)果[8]。抗原檢測時，只需將HRP偶聯(lián)抗原與固定相結(jié)合抗原換成可與病毒抗原結(jié)合的抗體，即雙抗體夾心法。

間接法主要用于抗體檢測，只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。捕獲法又稱反向間接法，多用于IgM的檢測，先將針對IgM的第二抗體包被與固相載體形成固相抗體；加入待測標本時，其中IgM類抗體(特異和非特異的)即可被固相抗體捕獲；再加入特異性抗原，其與固相上捕獲的IgM抗體結(jié)合后，加入酶標記特異性抗原的抗體，形成固相二抗-IgM-抗原-酶標記抗體復合物；加底物顯色后，即可對待測標本中IgM是否存在及含量進行測定[8]。

酶聯(lián)免疫吸附技術特異性較強，不需要特殊的儀器就可以進行定性檢測，通過酶標儀進行吸光度測量還可以在一定程度上進行定量檢測；但是其人工操作步驟相對繁復，將影響整體的檢測速度[15]。

3.2 膠體金免疫技術

膠體金免疫技術利用金顆粒的高電子密度特性，以膠體金作為示蹤標記物應用于免疫分析，膠體金標記實質(zhì)上就是將蛋白質(zhì)等高分子吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。

膠體金免疫技術包括有免疫膠體金光鏡染色法、免疫膠體金電鏡染色法、斑點免疫金滲濾法、膠體金免疫層析法。目前SARS-CoV-2抗體檢測試劑盒主要使用的方法為膠體金免疫層析技術[15]，包括已批準的IgM、IgG抗體檢測試劑盒。

膠體金免疫層析技術間接法檢測抗體過程如圖1所示，金標墊上吸附有膠體金標記的特異性抗原I,檢測區(qū)(T線)上固定的是特異性抗原Ⅱ，質(zhì)量控制區(qū)(C線)上固定有抗特異性抗原Ⅰ的抗體。樣品滴入樣品墊，待測抗體經(jīng)過金標墊，形成的抗體-金標記抗原在T線與抗原Ⅱ結(jié)合，游離的金標記抗原Ⅰ繼續(xù)向前到達C線與抗抗體結(jié)合，最后T線和C線將發(fā)生不同程度的顏色變化。抗原檢測則將金標記的抗原Ⅰ與檢測區(qū)固定的抗原Ⅱ換成可與病毒抗原結(jié)合的特異性抗體即可。該技術現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條的形式，使用十分方便。

圖1 膠體金免疫層析檢測抗體過程示意圖Fig.1 Colloidal gold immunochromatography detection process

在對新型冠狀病毒進行抗體檢測時，使用靜脈全血、血清或血漿樣品與稀釋劑混合，直接添加到樣品墊，等待10～15 min，就可以通過測試條上測試線與對照線的顏色來判斷結(jié)果。測試條和對照線都變?yōu)榧t色為陽性；測試條不變色、對照條為紅色，則為陰性[15]。

膠體金免疫技術操作簡單，不需要額外的儀器便可進行定性分析，可以對IgG和IgM進行綜合檢測或單獨檢測；與操作相對繁瑣的酶聯(lián)免疫吸附測定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 相比更具優(yōu)勢，并且反應迅速；但是這種技術的靈敏度比較差，無法進行定量檢測。目前已有4個企業(yè)的膠體金免疫層析分析的試劑盒被應急審批上市，適用于對臨床疑似病例進行快速篩查，特別是對于無其他免疫分析所需要的配套檢測儀器的地方。

3.3 熒光免疫層析技術

熒光免疫層析技術采用熒光物質(zhì)作為示蹤標記物，用于標記特異性抗體(或抗原)，再與待測的抗原(或抗體)結(jié)合，通過熒光檢測儀檢測其特異性熒光反應。根據(jù)熒光標記物種類的不同可分為熒光素免疫熒光層析技術、量子點免疫層析技術、上轉(zhuǎn)換納米粒子免疫層析技術。

熒光免疫層析技術的免疫反應過程與膠體金免疫層析技術一樣，只是用熒光標記物代替了膠體金進行顏色反應。與傳統(tǒng)膠體金標記的免疫層析技術相比，熒光免疫層析技術通過儀器直接檢測激發(fā)熒光信號進行測量，這種檢測方式具有較高的靈敏度，有利于進行準確定量；并且與酶催化顯色技術相比，避免了催化效率及底物量限制的問題，具有更寬的檢測范圍。

熒光免疫層析技術相對于酶聯(lián)免疫吸附技術和膠體金技術分辨率更高，檢測范圍更寬。雖然需要熒光分析儀進行測量，但與磁微?；瘜W發(fā)光技術相比所需要的試劑成本和儀器成本更低，特別是上轉(zhuǎn)納米粒子免疫層析技術，使用時間分辨熒光分析儀，擁有接近化學發(fā)光的分辨率[7]，可以進行準確的定量。

3.4 磁微?；瘜W發(fā)光免疫技術

化學發(fā)光免疫技術將化學發(fā)光與免疫技術結(jié)合，化學發(fā)光物質(zhì)吸收化學能從基態(tài)變成激發(fā)態(tài)，再從激發(fā)態(tài)釋放光能回到基態(tài)，發(fā)出的光子被發(fā)光信號檢測儀器接收從而對化學發(fā)光物質(zhì)進行測量?；瘜W發(fā)光免疫技術通過將化學發(fā)光物質(zhì)或催化化學物質(zhì)發(fā)光的酶標記在抗原或抗體上，作為示蹤標記物對抗原或抗體進行檢測。

磁微粒化學發(fā)光免疫分析技術綜合了磁微粒載體技術和化學發(fā)光免疫檢測技術。利用磁微粒作為固相載體，得到更高的比表面積，以及外加磁場的應用，可獲得更高的靈敏度和更快的檢測速度。目前8個被批準的抗體檢測試劑盒中有2個是應用了磁微?；瘜W發(fā)光免疫技術。

磁微?；瘜W發(fā)光免疫技術靈敏度高、特異性強、檢測范圍寬，通過相對發(fā)光強度(PLV)來表征測量結(jié)果。目前已有比較成熟的全自動化學發(fā)光免疫分析儀，便于實現(xiàn)自動快速測量，可以準確地對IgG、IgM進行區(qū)分測量，對患者IgG與IgM水平實現(xiàn)追蹤檢測，從而可以更加準確地區(qū)分COVID-19與其他一些疾病。但是其試劑成本較高，需要借助特定的化學發(fā)光儀才能進行測量，比較適用于重度感染地區(qū)的醫(yī)院、疾控機構(gòu)等有大量患者需要準確定量檢測的地方[9]。

4 討論與展望

病毒的免疫診斷技術包括抗體檢測和抗原檢測，都是基于免疫反應進行檢測?？乖瓩z測需要制備與病毒蛋白特異性結(jié)合的抗體(單克隆抗體或多克隆抗體)，常通過免疫動物制備，制備過程比較復雜，耗時較長?？贵w檢測需要可以與免疫反應產(chǎn)生的抗體相結(jié)合的抗原，而重組抗原的表達純化技術相對于抗體的免疫采集純化，技術相對簡單、時間周期相對較短；因此，目前研制成功的新冠病毒抗體檢測試劑盒的數(shù)量遠多于其抗原檢測試劑盒，被批準上市的免疫診斷試劑盒也都是抗體檢測試劑盒。但是，患病初期血清中沒有可檢測到的抗體，所以抗體檢測無法對該階段的感染者進行篩查；這時想要通過免疫學方法篩查，需要使用抗原檢測，盡快研發(fā)并批準可用于臨床診斷的抗原試劑盒變得非常重要。

表1給出了不同免疫分析方法的優(yōu)點及其局限性。

表1 不同免疫分析方法比較Tab.1 Comparison of different immunoassay methods

目前批準的抗體檢測試劑盒，基于抗體的免疫學檢測存在假陽性情況，主要是由于內(nèi)源性干擾物質(zhì)，有相當比例的標本不同程度地含有內(nèi)源性(如嗜異性抗體、補體、溶菌酶)、外源性(如標本溶血、細菌污染、標本凝固)的各種干擾物質(zhì)[11]，從而導致測定結(jié)果的假陽性，因此檢測試劑盒質(zhì)量和檢測過程的質(zhì)量控制十分重要。新型冠狀病毒抗原抗體檢測試劑盒質(zhì)量，以及建立相關的免疫分析方法的可行性和測量結(jié)果的量值溯源，需要研制相關標準物質(zhì)和標準化程序進行質(zhì)量控制。

目前，中國計量科學研究院已研發(fā)了滿足病毒抗體和抗原檢測并具有溯源性計量意義的新型冠狀病毒人源IgG單克隆抗體標準物質(zhì)和新型冠狀病毒核衣殼蛋白溶液標準物質(zhì)，對抗原抗體檢測和產(chǎn)品的質(zhì)量控制起到重要支撐作用；同時，期望最終建立應對生物安全威脅因子測量的質(zhì)量控制標準體系。