齊巧明，龍 旭，羅 鳳，高曉敏，雷亞婷，靳如意，郭 惠

(陜西中醫(yī)藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046)

艾葉是菊科植物艾屬(ArtemisiaargyiLevl.et Vant.)的干燥葉，味辛、苦，無毒，歸肝、脾和腎經[1-5]。艾葉主要分布在亞洲東部，如日本、蒙古，我國的華北、華東、華南、東北、陜西和甘肅等地[3,6]。艾葉富含多種生物活性成分，包括揮發(fā)油、甾萜類、有機酸、黃酮類和多糖等[5,7]。艾葉及其揮發(fā)油具有驅寒除濕、殺蟲止癢、鎮(zhèn)咳平喘、美白、通經活絡、抗過敏、抗菌和安胎等功效，在醫(yī)藥、食品、香料及化學工業(yè)中應用廣泛[5-10]。艾葉揮發(fā)油成分主要由脂肪類、萜類和芳香類化合物構成，約100余種，主要為桉油精、側柏酮、龍腦、α-松油醇、β-松油烯、檸檬醛等[2,11]。目前對艾葉揮發(fā)油的研究主要集中于化學成分和藥理作用，但有關其抗氧化活性的研究鮮有報道。鑒于此，作者采用單因素實驗和響應面法優(yōu)化艾葉揮發(fā)油的共水蒸餾提取工藝，并通過測定艾葉揮發(fā)油對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的清除率來評價其抗氧化性能，為艾葉揮發(fā)油資源的開發(fā)利用提供理論依據。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

艾葉，購于藥材市場。

液體石蠟、氯化鈉、無水乙醇，分析純，天津天力化學試劑有限公司；無水硫酸鈉，分析純，重慶茂業(yè)化學試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，分析純，Sigma-Aldrich公司。

JM-B10002型電子天平,諸暨超澤衡器設備有限公司；HX-200型粉碎機；HJ-3A型恒溫磁力攪拌器；電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；UV1102型紫外可見分光光度計，日本島津；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵。

1.2 艾葉揮發(fā)油的提取

將艾葉置于電熱鼓風干燥箱中40 ℃干燥24 h，粉碎后過20目篩，備用。稱取一定量的艾葉粉末置于500 mL三頸燒瓶中，加入360 mL蒸餾水，浸泡一段時間，于100 ℃下回流一段時間；將提取液轉入分液漏斗中，加入2.0 g氯化鈉加速油水分離，靜置24 h；分層后將上層油相轉入燒杯中，加入1.0 g無水硫酸鈉進行干燥處理，純化后稱重，按式(1)計算艾葉揮發(fā)油的提取率：

(1)

1.3 艾葉揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化

1.3.1 單因素實驗

1.3.1.1 浸泡時間

準確稱取60.0 g艾葉粉末置于500 mL三頸燒瓶中，加入360 mL蒸餾水，分別浸泡0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h后于100 ℃回流3.0 h；將艾葉提取液轉入分液漏斗中，加入2.0 g氯化鈉加速油水分離，靜置24 h；分層后將上層油相轉入燒杯中，加入1.0 g無水硫酸鈉進行干燥處理，得到艾葉揮發(fā)油，稱重。

1.3.1.2 料液比

分別按料液比(g∶mL，下同)1∶6、1∶8、1∶10、1∶12準確稱取艾葉粉末置于500 mL三頸燒瓶中，加入適量蒸餾水，浸泡1.5 h后于100 ℃回流3.0 h；后續(xù)操作同1.3.1.1。

1.3.1.3 提取時間

準確稱取60.0 g艾葉粉末置于500 mL三頸燒瓶中，加入360 mL蒸餾水，浸泡1.5 h后于100 ℃分別回流1.5 h、3.0 h、4.5 h、6.0 h；后續(xù)操作同1.3.1.1。

1.3.2 響應面法實驗

在單因素實驗的基礎上，選取浸泡時間(A)、料液比(B)和提取時間(C)作為Box-Behnken實驗設計的3個因素，結合響應面法的設計原理，采用3因素3水平的設計方案，選取3個零點，共15組實驗，響應面法實驗的因素與水平見表1。

表1響應面法實驗的因素與水平

Tab.1 Factors and levels of response surface methodologies

水平因素A.浸泡時間/hB.料液比/(g∶mL)C.提取時間/h-11.01∶123.001.51∶104.512.01∶86.0

1.4 抗氧化性能研究

DPPH自由基溶液的配制：精確稱取8.00 mg的DPPH標準品，用無水乙醇溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，搖勻，得質量濃度為0.08 mg·mL-1的DPPH自由基溶液，冷藏備用。

準確移取3.00 mL 0.08 mg·mL-1的DPPH自由基溶液于10 mL離心管中，加入3.00 mL無水乙醇混合均勻后，于516 nm處測定吸光度(A0)；分別移取3.00 mL 0.08 mg·mL-1的DPPH自由基溶液于6支10 mL離心管中，分別加入濃度為5.0 mg·mL-1、10.0 mg·mL-1、20.0 mg·mL-1、40.0 mg·mL-1、60.0 mg·mL-1、80.0 mg·mL-1的艾葉揮發(fā)油乙醇溶液3.00 mL，室溫靜置30 min，于516 nm處測定吸光度(A1)；分別移取3.00 mL無水乙醇于6支10 mL離心管中，加入不同濃度的艾葉揮發(fā)油溶液，在516 nm處測定吸光度(A2)。每個樣品重復測定3次，取平均值。按式(2)計算DPPH自由基清除率：

(2)

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 浸泡時間對艾葉揮發(fā)油提取率的影響(圖1)

圖1 浸泡時間對艾葉揮發(fā)油提取率的影響Fig.1 Effect of soaking time on extraction rate of Artemisia argyi volatile oil

從圖1可以看出，隨著浸泡時間的延長，艾葉揮發(fā)油提取率先升高后降低，當浸泡時間達到1.5 h時，提取率最高，為0.67%。這是由于，水逐漸向艾葉內部滲透，并以它為載體將揮發(fā)油逐步擴散到艾葉表面，浸泡時間越長，擴散越完全；但浸泡時間過長，內部有效成分逐漸揮發(fā)損失，揮發(fā)油提取率反而下降。因此，確定最佳浸泡時間為1.5 h。

2.1.2 料液比對艾葉揮發(fā)油提取率的影響(圖2)

圖2 料液比對艾葉揮發(fā)油提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of Artemisia argyi volatile oil

從圖2可以看出，隨著料液比的減小，即提取溶劑用量的增加，揮發(fā)油提取率先降低后升高而后再降低，當料液比為1∶10時，提取率最高，達到0.75%，而當料液比為1∶12時，提取率最低，為0.33%。這是由于，液料比過大時，溶劑用量相對過少，導致揮發(fā)油提取不完全，提取率較低；但是若溶劑用量過多，揮發(fā)油在水中的溶解量增大，減少了揮發(fā)油的相對含量，也會導致揮發(fā)油提取率降低。綜合考慮，確定最佳料液比為1∶10。

2.1.3 提取時間對艾葉揮發(fā)油提取率的影響(圖3)

圖3 提取時間對艾葉揮發(fā)油提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of Artemisia argyi volatile oil

從圖3可以看出，隨著提取時間的延長，艾葉揮發(fā)油提取率先升高后降低，當提取時間為4.5 h時，揮發(fā)油提取率最高，為0.83%。這是由于，溶劑水將干燥的艾葉粉末浸潤并溶解出有效成分需要一定時間，延長提取時間有利于揮發(fā)油的提取，但在有效成分完全擴散的前提下，繼續(xù)延長提取時間，反而會導致揮發(fā)油中的有效成分揮發(fā)，提取率降低。因此，確定最佳提取時間為4.5 h。

2.2 響應面法實驗結果

2.2.1 響應面法實驗方案設計與結果(表2)

表2響應面法實驗方案設計與結果

Tab.2 Design and results of response surface methodologies

實驗號A.浸泡時間B.料液比C.提取時間Y.提取率/%11010.7720000.8230000.834-1-100.6951100.8060110.7870-1-10.728-1010.7690-110.7810-1100.741110-10.761201-10.80130000.83141-100.7715-10-10.65

對回歸方程進行方差分析，結果見表3。

從表3可知，模型F值為21.22，P<0.01，說明二次回歸方程具有高度顯著性，模型與實驗實際擬合度良好，實驗誤差相對較小，能較好地反映艾葉揮發(fā)油提取率與浸泡時間、料液比和提取時間之間的關系。二次項中除浸泡時間與料液比的交互作用不顯著(P>0.05)外，其它作用均顯著。失擬項代表模型中的數據變異，該方程的失擬項F值為8.50>0.05，說明模型的擬合情況良好。根據F值和P值大小可知，各因素對揮發(fā)油提取率的影響大小依次為：浸泡時間>料液比=提取時間。

2.2.2 響應面分析

采用Design-Expert軟件擬合分析浸泡時間、料液比和提取時間對揮發(fā)油提取率的交互作用三維響應面圖，如圖4所示。

表3 方差分析結果

Tab.3 Results of variance analysis

注：**為高顯著水平(P≤0.01)，*為顯著水平(0.01

圖4 各因素交互作用對艾葉揮發(fā)油提取率影響的響應面分析Fig.4 Response surface analysis for effect of interaction between each factor on extraction rate of Artemisia argyi volatile oil

響應面圖和等高線圖能夠直觀地反映出各因素之間相互作用對響應值的影響。等高線的形狀反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則表示兩因素交互作用較弱。從圖4可以看出，浸泡時間與料液比的交互作用、浸泡時間與提取時間的交互作用、料液比與提取時間的交互作用均顯著。經Design-Expert軟件分析艾葉揮發(fā)油的最佳提取工藝條件為：浸泡時間1.628 h、料液比1∶8.85、提取時間4.611 h，在此條件下，艾葉揮發(fā)油提取率為0.836%。結合實際操作情況，將最佳提取工藝條件修正為：浸泡時間1.5 h、料液比1∶10、提取時間4.5 h。

2.2.3 工藝驗證

在最佳提取工藝條件下進行3次驗證實驗，揮發(fā)油提取率分別為0.83%、0.82%和0.83%，相對平均偏差為0.52%，相對標準偏差RSD為0.70%，說明基于Box-Behnken實驗設計獲得的最佳提取工藝參數可靠，具有實用價值。

2.3 艾葉揮發(fā)油的抗氧化性能

DPPH自由基是一種以氮為中心的自由基，作為一種穩(wěn)定的自由基，在紫外區(qū)300～400 nm之間具有強烈吸收，溶液呈深紫色，但被中和之后會變?yōu)闊o色或淺黃色。因此，本研究采用DPPH自由基清除率來考察艾葉揮發(fā)油的抗氧化性能。艾葉揮發(fā)油濃度對DPPH自由基清除率的影響如圖5所示。

圖5 艾葉揮發(fā)油濃度對DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of Artemisia argy volatile oil concentration on scavenging rate of DPPH free radicals

從圖5可以看出，艾葉揮發(fā)油濃度對DPPH自由基清除率的影響較大，呈一定的濃度依賴性。當艾葉揮發(fā)油濃度為80 mg·mL-1時，DPPH自由基清除率最高，為39.12%。

3 結論

以艾葉揮發(fā)油提取率為考核指標，采用單因素實驗考察浸泡時間、料液比、提取時間等對艾葉揮發(fā)油提取率的影響，在此基礎上，采用響應面法優(yōu)化艾葉揮發(fā)油的共水蒸餾提取工藝，并通過紫外分光光度法測定艾葉揮發(fā)油對DPPH自由基的清除率來評價其抗氧化性能。確定艾葉揮發(fā)油的最佳提取工藝條件為：浸泡時間1.5 h、料液比1∶10、提取時間4.5 h，在此條件下，艾葉揮發(fā)油提取率最高，為0.83%。當艾葉揮發(fā)油濃度為80 mg·mL-1時，DPPH自由基清除率最高，為39.12%，表明艾葉揮發(fā)油具有一定的抗氧化活性。采用響應面法對艾葉揮發(fā)油共水蒸餾法提取工藝條件進行優(yōu)化，可有效降低工藝操作條件的摸索次數，為艾葉類產品的進一步開發(fā)奠定基礎。