林亞娟，徐 偉，葉 淼，褚克丹，盧曉藝，連 紅，王曉穎

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病，coronary heart disease，CHD)是一種較為常見的心血管疾病，它的一個重要標(biāo)志是動脈粥樣硬化斑塊。斑塊會隨時間的推移使冠狀動脈發(fā)生慢性狹窄、痙攣或阻塞，從而導(dǎo)致心肌缺血、缺氧或梗死而引發(fā)心臟病[1-4]。近年來，中醫(yī)中藥對心肌缺血保護作用的研究日趨增多，人們應(yīng)用中藥預(yù)防和治療心肌缺血損傷取得了較好的效果，研發(fā)的中藥制劑不斷增多[5-6]。舒冠通糖漿是應(yīng)用漆樹科鹽膚木(RhusChinensisMill.,YFM)的干燥根莖經(jīng)水提醇沉后制成的單味藥糖漿劑，具有理氣行血、活血化瘀等功效，臨床上主要用于冠心病、心絞痛的治療，其療效確切。課題組前期基于YFM對斑馬魚冠心病模型的篩選，證實YFM抗冠心病的有效部位為總酚酸。同時，課題組前期將舒冠通糖漿進行劑型的二次開發(fā)，改良為YFM總酚酸微丸。有研究表明，YFM對垂體后葉素(pituitrin，pit)引起的大鼠急性心肌缺血具有保護作用[7-8]。本研究在前期課題組的研究背景下，建立舌下靜脈注射pit致大鼠急性心肌缺血模型，采用預(yù)防灌胃給藥，探討YFM總酚酸微丸對急性心肌缺血的預(yù)防性保護作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 雄性SPF級SD大鼠，體質(zhì)量(250±20)g[上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK(滬)2012-0002]。

1.1.2試藥 地奧心血康膠囊(批號：1801051，規(guī)格：100 mg，成都地奧制藥集團有限公司)；硝苯地平(批號：20180304，規(guī)格：10 mg，華中藥業(yè)股份有限公司)；本實驗用YFM粗提物(YFM粗提物：YFM塊莖以70%乙醇提取后取澄清濾液為YFM粗提物，1.84 g/mL)、YFM總酚酸(YFM總酚酸：YFM塊莖以70%乙醇提取后取澄清濾液經(jīng)大孔樹脂純化得到，39 g/mL)[9]和YFM提取物微丸(YFM微丸，自制，載藥量：28.7%，136 g/mL，批號：20181027)[10]與YFM生藥量對等關(guān)系相同；pit注射液(pit，規(guī)格：6 U：2 mL，批號：1704201，上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(96T)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)試劑盒(50T)(南京建成生物工程研究所)。

1.1.3儀器 生物機能實驗系統(tǒng)(BL-420A，成都泰盟軟件有限公司)，電子分析天平(XS105，梅特勒-托利多儀器有限公司)，臺式冷凍離心機(美國貝克曼庫爾特公司)，離心機(5418-Eppendorf，德國艾本德股份有限公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4，常州國華電器有限公司)，旋渦混合振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，多功能酶標(biāo)儀(奧地利Infinite公司)，紫外分光光度計(UV-1800，日本島津公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組與造模 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，10%水合氯醛麻醉，測定大鼠心電圖，篩選出56只肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖正常(麻醉后S點不高于基線)的大鼠，將篩選出的大鼠隨機分為7組：對照組、模型組、地奧心血康膠囊組(0.061 3 g/kg)、硝苯地平組(6.13 mg/kg)、YFM粗提物組(9.2 g/kg)、YFM總酚酸組(0.195 g/kg)、YFM微丸組(0.68 g/kg)，每組8只。其中，YFM粗提物、YFM總酚酸和YFM微丸用量根據(jù)YFM生藥量進行換算，舒冠通糖漿每日服用量為30 mL，相當(dāng)于45 g YFM生藥材。YFM生藥材經(jīng)提取、純化后，按人的常用劑量的等效劑量計算，YFM粗提物和YFM總酚酸分別為0.75 g/kg和16 mg/kg，折算成大鼠給藥劑量分別為4.6 g/kg和98.08 mg/kg；YFM微丸的載藥量(即含YFM總酚酸的量)為28.7%，則YFM微丸的給藥劑量為342 mg/kg，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，最終選擇給藥劑量的兩倍量即0.68 g/kg作為YFM微丸的研究劑量，相對應(yīng)的YFM粗提物的劑量為9.2 g/kg，YFM總酚酸的劑量為0.195 g/kg。對照組和模型組灌胃給水10 d，其余連續(xù)灌胃給藥10 d；給藥(水)體積為5 mL/kg。最后一次給藥2 h后，采用舌下靜脈注射pit 1 U/kg的方法建立急性心肌缺血模型，用BL-420 A生物機能實驗系統(tǒng)記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。舌下靜脈注射pit引起大鼠心肌缺血時，通過觀察心電圖ST段的變化通?？煞譃閮善?，第一期注射后5～30 s T波升高，ST段抬高(>0.1 mV)；第二期注射后30 s至數(shù)分鐘，ST段下移，T波降低、平坦、雙向或倒置，心率減慢，P-R及Q-T間期延長。出現(xiàn)第一期或第二期缺血性變化為陽性，否則為陰性[6]。本研究模型組注射pit后30 s前ST段抬高超過0.1 mV，30 s后ST段下移，T波低平或者倒置，與文獻報道一致，說明造模成功。

1.2.2指標(biāo)檢測

1.2.2.1心肌缺血大鼠心電圖變化的測定 10%水合氯醛腹腔注射麻醉后固定在手術(shù)臺板上，四肢皮下插入注射用針頭，用鱷魚夾將針頭連接肢導(dǎo)聯(lián)，記錄大鼠肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖；以PP連線為基線，記錄注射pit前及注射完pit后0，5，10，15，30，60，300，600 s的心電圖ST段值，并分析各組注射pit 前后ST段變化。觀察并記錄心電圖中室性心律失常發(fā)生率及心肌缺血陽性率。當(dāng)心電圖出現(xiàn)寬大或畸形的QRS波、無P波或P波倒置逆反、心律不齊等一項者記為心律失常。當(dāng)出現(xiàn)下列指征一項者即為心肌缺血性陽性：J點升高1.5 mV以上，T波降低50%以上，雙向、倒置，ST段抬高0.1 mV或壓低0.5 mV，心率不齊。觀察并記錄舌下靜脈注射pit前后ST段的波動情況及心率的改變。

1.2.2.2心肌缺血大鼠血清生化指標(biāo)的檢測 測定心電圖后，大鼠腹主動脈取血5 mL，室溫放置2 h，離心10 min(3 500 r/min)，小心移取血清置EP管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩y定時取出血清，快速解凍，嚴格按照試劑盒步驟進行操作，測定血清中LDH和CK的活性[11]。

2 結(jié) 果

2.1心肌缺血大鼠心電圖ST段變化 模型組大鼠注射pit后的前30 s ST段明顯抬高，ST段值抬高超過0.1 mV，與對照組比較，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明造模成功，造模后通過實時監(jiān)測得到各組大鼠典型心電圖見圖1。通過統(tǒng)計分析可見，舌下靜脈注射pit進行造模前各組ST段比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義，說明灌胃給藥對正常大鼠的心電圖無影響。觀察注射pit后5，10及15 s的心電圖發(fā)現(xiàn)，各給藥組的ST段雖有抬高，但與模型組比較，第一期ST段抬高的幅度有所降低，其ST段抬高值均<0.1 mV；與模型組比較(除YFM粗提物)，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或0.01)。從表1可見，YFM粗提物組、YFM總酚酸組及YFM微丸組的ST段最大變化量分別為0.080，0.062，0.059 mV，數(shù)值顯示ST段最大變化量：YFM微丸組

2.2心肌缺血大鼠心率變化 舌下靜脈注射pit后，各組(對照組除外)大鼠的心率在10 min內(nèi)均隨著時間的延長而逐步減慢，模型組在各時間點的心率減慢尤為顯著，與對照組比較，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；各給藥組心率雖有減慢，但與對照組比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。注射pit 5 s時，模型組心率降低幅度較大，與對照組比較，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；10 s時各給藥組(除YFM粗提物)心率均有所下降，但其下降的幅度小于模型組，心率顯著高于模型組(P<0.05或0.01)；600 s時，對照組、地奧心血康膠囊組、硝苯地平組和YFM微丸組心率顯著高于模型組(P<0.01)，且YFM微丸組與地奧心血康膠囊組和硝苯地平組比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，YFM粗提物組與YFM微丸組配對t檢驗顯示，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表1 急性心肌缺血大鼠心電圖ST段變化測定結(jié)果

2.3心肌缺血大鼠血清生化指標(biāo)結(jié)果 與對照組比較，舌下靜脈注射pit模型組大鼠血清中LDH和CK的活性水平升高較為明顯，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，各給藥組血清中LDH和CK的活性水平均有所降低，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；YFM各組與陽性對照藥地奧心血康膠囊和硝苯地平組比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)。YFM各組間配對比較，YFM總酚酸組LDH活性顯著低于YFM粗提物組(P<0.05)(表3)。

表2 急性心肌缺血大鼠心率測定結(jié)果

表3 注射pit致急性心肌缺血大鼠血清生化指標(biāo)測定結(jié)果

Tab 3 The detection results of serum biochemical index of acute myocardial ischemia in rats induced by sublingual injection of pituitrin

分 組ρLDH/(U·L-1)ρCK/(U·mL-1)對照組6 061.20±1 449.26▲2.61±0.32▲模型組10 198.44±2 116.009.08±1.44地奧心血康膠囊組7 967.80±728.96▲3.62±1.07▲硝苯地平組7 065.94±2 622.75▲3.30±1.09▲YFM粗提物組8 636.20±771.58△3.40±0.76▲YFM總酚酸組7 671.01±955.80▲4.30±1.03▲YFM微丸組7 897.97±936.90▲4.45±1.16▲

3 討 論

舌下靜脈的毛細血管較為豐富，采用舌下靜脈注射大劑量pit可迅速由毛細血管吸收，從而使冠狀動脈血管腔發(fā)生痙攣，引起心臟供血不足，同時造成全身小血管的強烈收縮，導(dǎo)致血壓升高，心臟后負荷加重，最終引發(fā)急性心肌缺血缺氧[12]，因此給大鼠舌下靜脈注射pit后，可通過觀察各個時間點的心電圖變化，記錄急性心肌缺血較為典型的變化。注射pit導(dǎo)致的急性心肌缺血損傷具有漸進性，和人體急性心肌缺血損傷具有較高的相似度，其心電圖變化和人體心電圖基本一致，并且該方法靈敏度高、操作簡便，實驗周期短，可通過直接實時監(jiān)測心電圖的變化情況大致判斷結(jié)果，被廣泛用于抗心肌缺血缺氧藥物的篩選[5]。文獻報道，YFM的水提液對注射pit引起的急性心肌缺血缺氧的大鼠具有一定的保護作用[7-8]，因此，本研究采用該模型探討YFM總酚酸及其微丸對急性心肌缺血的保護作用。

YFM微丸為舒冠通糖漿的二次開發(fā)產(chǎn)品，舒冠通糖漿在臨床上主要用于冠心病、心絞痛的治療，為中成藥。本研究同時選擇治療急性心肌缺血的西藥硝苯地平和與YFM微丸功能主治相近的中成藥地奧心血康膠囊為陽性對照藥，對YFM微丸進行急性心肌缺血的藥效學(xué)研究，以便更好地衡量YFM微丸的抗急性心肌缺血效果。結(jié)果顯示，在心肌缺血大鼠心電圖ST段變化和心率變化以及降低LDH活性等方面，YFM微丸的抗急性心肌缺血方面的研究結(jié)果顯示，其效果更接近于地奧心血康膠囊組。

心肌缺血性損傷的范圍和程度可直接通過觀察心電圖ST段的改變得知。本研究通過舌下靜脈注射pit造成大鼠急性心肌缺血，對YFM提取物及其微丸進行藥效學(xué)評價，大鼠肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖表明，YFM總酚酸和YFM總酚酸微丸能夠顯著抑制pit引起的ST段的變化，抑制ST段第一期的抬高和第二期的降低，同時可降低大鼠心律失常的發(fā)生率和心率的改變。本研究結(jié)果表明：YFM總酚酸和YFM總酚酸微丸對急性心肌缺血的大鼠具有明顯的保護作用，而YFM粗提物對于減輕pit致急性心肌缺血的作用也有一定的作用，但其作用弱于前兩者，這可能是YFM提取物經(jīng)過大孔樹脂純化后，大部分雜質(zhì)被除去，有效成分被富集，使其含量提高，因此增強了對pit致急性心肌缺血的保護作用。另外YFM總酚酸微丸對pit致急性心肌缺血的保護作用比YFM總酚酸略為明顯，可能是YFM總酚酸制成微丸后劑型的改變能夠促進有效成分在體內(nèi)的吸收。

LDH和CK是評價心肌損傷的重要指標(biāo)。急性心肌缺血缺氧使心肌細胞膜受到損傷，進而產(chǎn)生大量的氧自由基，使LDH和CK被大量釋放入血，導(dǎo)致血清中的LDH及CK水平顯著升高[13-14]。本研究結(jié)果表明，YFM總酚酸及其微丸能顯著降低pit誘導(dǎo)急性心肌缺血模型大鼠血清中LDH和CK的活性，提示YFM總酚酸微丸對心肌細胞的細胞膜具有保護作用，從而減少LDH及CK的漏出。

綜上所述，YFM總酚酸及其微丸可抑制pit致大鼠心肌缺血心電圖ST段的抬高和改善T波的變化，對心肌缺血和心律失常情況均有所改善，能顯著降低pit致大鼠心肌缺血血清中CK和LDH的量，說明YFM總酚酸及其微丸有明顯的抗心肌缺血的保護作用。本研究為YFM總酚酸微丸的進一步開發(fā)提供了實驗支持，但YFM總酚酸微丸發(fā)揮心肌保護作用的機制尚未明確，有待課題組進一步研究。