代泳波 熊銳

硼酸（硼砂）曾作為食品防腐劑和膨松劑被用于水產(chǎn)品、肉制品及面食制品等食品中，但由于其具有較強毒性而被禁用，原衛(wèi)生部發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單（第1-5批匯總）》中明確將硼酸與硼砂列入食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單，即任何食品中不得檢出。食品中硼酸與硼砂檢測方法依據(jù)《食品安全國家標準 食品中硼酸的測定》（GB 5009.275-2016），其原理為通過乙基己二醇-三氯甲烷溶液對樣品中的硼酸（硼砂）進行快速的富集、萃取，除去共存鹽類的影響，利用硫酸與姜黃混合生成的質(zhì)子化姜黃與硼酸反應(yīng)生成紅色產(chǎn)物，溶液顏色的深淺與樣品中硼酸（硼砂）含量成正比，通過分光光度計定量測定樣品中硼酸（硼砂）的含量。但在實際樣品檢測過程中有時會出現(xiàn)同一濃度標準品的顯色深淺有差異且標準曲線線性不好的情況，為探究導致顯色不穩(wěn)定的原因，按照實驗步驟，根據(jù)日常檢測過程中可能出現(xiàn)的因素逐步進行原因分析并設(shè)計以下實驗。

一、實驗材料

1.試劑：蒸餾水，無水乙醇（AR），冰醋酸（AR），三氯甲烷（AR），2-乙基-1，3-己二醇（AR），硼酸標準溶液（500μg/mL）。

2.儀器、器皿：雙光束紫外可見分光光度計（TU1900北京普析通用儀器有限責任公司），渦旋振蕩器（EYELA上海愛朗儀器有限公司），千分之一電子天平（JY203上海浦春計量儀器有限公司），50ml塑料離心管，100mL塑料容量瓶，200mL塑料燒杯，快速濾紙。

二、實驗方法及結(jié)果分析

1.不同姜黃色素對顯色的影響。GB 5009.275-2016中提到的顯色劑為姜黃色素，姜黃色素是以姜黃素為主的一種黃色略帶酸性的二苯基庚烴物質(zhì)的統(tǒng)稱，主要包括姜黃素（C21H20O6，分子量368，約占70%）、脫甲氧基姜黃素（C20H18O5，分子量338，約占15%）和雙脫甲氧基姜黃素（C19H16O4，分子量308，約占10%），及四氫姜黃素、脫甲氧基四氫姜黃素、雙脫甲氧基四氫姜黃素。檢驗過程中會使用到不同品牌的姜黃色素，為驗證不同姜黃色素對顯色的影響，在其他試劑及實驗條件一致的情況下，使用5種姜黃色素做顯色劑分別做標準曲線對比。試驗結(jié)果如下。

根據(jù)圖1數(shù)據(jù)可知，不同的姜黃色素，除了四氫姜黃素不顯色外，其他色素均能顯色且標準曲線均成直線，整體吸光度值略有差異。根據(jù)表3的數(shù)據(jù)可知，在能顯色的色素中，不含硼酸時除進口姜黃素顯紅色外，其他姜黃素均為黃色，吸光度值差異不大；含有硼酸時，相同濃度下雙去甲氧基姜黃素顯色最淺，進口姜黃素顯色最深，含甲氧基多的姜黃色素顏色深于含甲氧基少的姜黃色素，國產(chǎn)和進口的姜黃素顯色深淺也不一樣。因此在日常檢測過程中出現(xiàn)顯色不一致的情況，主要原因是使用了不同品牌的姜黃素，但只要使用能顯色的姜黃色素，均能保證標準曲線線性正常，不會導致檢測結(jié)果不穩(wěn)定。

根據(jù)表4的驗證結(jié)果來看，隨著標準品過濾液靜置時間的延長，顯色略有加深，短時間內(nèi)吸光度值變化不大。因此在樣品檢測過程中，如果因為檢測樣品過多導致樣品待測液靜置時間過長，并不會導致顯色異常。

3.濃硫酸對顯色的影響。濃硫酸在顯色過程中的作用是將姜黃素質(zhì)子化，再與硼酸發(fā)生顯色反應(yīng)。但是在日常檢測過程中使用的濃硫酸不能保證每次都是同一品牌、同一級別、同一批次，且濃硫酸在使用過程中避免不了與空氣接觸而吸收空氣中的水分。為驗證濃硫酸對顯色的影響，特設(shè)計如下實驗：

（1）使用不同品牌、不同級別及不同批次的濃硫酸，其他條件一致，僅檢測標準品吸光度值，驗證數(shù)據(jù)見表5。根據(jù)表5的結(jié)果來看，無論是分析純、優(yōu)級純還是不同品牌的硫酸，對顯色不存在明顯的差異。

（2）使用同一品牌、同一批次但啟用時間不同的的濃硫酸，其他條件一致，僅檢測標準品吸光度值，驗證數(shù)據(jù)見圖2。根據(jù)圖2的驗證結(jié)果，使用的濃硫酸會隨啟用時間的延長而導致顯色越來越淺。當一瓶濃硫酸頻繁開啟使用或使用周期太長，就會導致顯色非常淺且標準曲線線性差，影響檢測結(jié)果。原因是高于70%濃硫酸都具有吸水性，頻繁使用的濃硫酸會在使用過程中吸收空氣中的水分導致濃度下降，如果在顯色過程中使用了此類濃硫酸就會導致顯色異常。因此在檢測過程中要盡量選擇新開啟或開啟時間不長的濃硫酸，從而保證檢測結(jié)果準確且穩(wěn)定。

4.顯色時間及顯色后靜置時間長短對顯色的影響。根據(jù)GB 5009.275-2016中5.2中關(guān)于顯色的描述：“各取1.00mL過濾液于50mL塑料試管中，依次加入姜黃-冰乙酸溶液1.0mL、硫酸0.5mL，搖勻，靜置30min，加無水乙醇25mL，靜置10min。”其中對顯色時間要求30min，對定容后靜置時間要求10min，但是實際檢測過程中，當檢測樣品數(shù)量較多時會出現(xiàn)實際顯色時間和靜置時間過長的問題，為驗證該因素是否會對檢測結(jié)果造成影響，設(shè)計如下實驗：

（1）僅做標準曲線，減少前后時間差，其他條件完全一致，分別將顯色時間設(shè)置為30-60min，查看顯色情況，實驗驗證結(jié)果見表6。根據(jù)表6的驗證數(shù)據(jù)，隨著顯色時間的延長，吸光度值略有上升但整體變化不大。

（2）僅做標準曲線，減少前后時間差，其他條件完全一致，分別將顯色后靜置時間設(shè)置為10-60min，查看顯色情況，實驗驗證結(jié)果見表7。根據(jù)表7的驗證數(shù)據(jù)，定容后靜置時間超過10min，吸光度值幾乎沒有發(fā)生變化。因此檢測樣品數(shù)量較大導致顯色時間和顯色后靜置時間過長并不會引起顯色異常，不會影響檢測結(jié)果。

5.檢測環(huán)境溫度對顯色的影響。三氯甲烷和冰醋酸具有刺激性，必須在通風柜中進行操作，而通風柜中很難控制環(huán)境溫度，不同季節(jié)的環(huán)境溫度差異也較大。為驗證在不同溫度下的顯色情況，特設(shè)計如下實驗：將處理后的標準品過濾液和顯色所需濃硫酸、姜黃色素和定容用乙醇分別置于室溫下通風柜（約20℃）、鼓風冷藏柜（約5℃）和鼓風恒溫箱（約35℃）中，在測量吸光度值前的操作全部置于各自溫度條件中進行，顯色后測量吸光度值，實驗驗證結(jié)果見表8。

根據(jù)表8的驗證結(jié)果，在不同溫度下，同一濃度標準品過濾液吸光度值變化不大，因此不會出現(xiàn)因為環(huán)境溫度的不同而導致顯色異常。

綜合以上實驗得出如下結(jié)論：按照G B 5009.275-2016檢測硼酸的過程中，出現(xiàn)顯色情況不一致是使用不了不同的姜黃色素，不同的姜黃色素顯色會有深淺差異，部分色素存在紅色本底，但不影響標準曲線和檢測結(jié)果。而日常的檢測過程中可能遇到的樣品待測液靜置時間過長、顯色反應(yīng)時間過長、定容后靜置時間過長、反應(yīng)溫度過低過高都不會對顯色造成明顯的影響。影響檢測結(jié)果穩(wěn)定性的因素是使用了不同濃度的濃硫酸，如果濃硫酸開啟時間過長且期間反復使用，會導致濃硫酸吸水而濃度下降，使用了濃度下降的濃硫酸進行顯色反應(yīng)會導致顯色異常，造成檢測結(jié)果不穩(wěn)定。為保證檢測過程中顯色穩(wěn)定，需使用新開啟的濃硫酸或開啟后使用次數(shù)較少、保存良好的濃硫酸。