何玉欣 張雨微 雷 新 王雨亭 李 倩 付 靜

皖南醫(yī)學(xué)院，安徽省蕪湖市 241002

阿爾茨海默氏癥(Alzheimer’s Disease, AD)是一種起病隱匿的以進行性癡呆為癥狀的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。病理學(xué)上，AD由淀粉樣β斑塊(Aβ)、含有磷酸化tau蛋白(p-tau)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)和腦血管病組成[1]?；颊哂捎谕挥|的逐漸喪失以及神經(jīng)元的死亡而發(fā)生學(xué)習(xí)和記憶障礙[2]。目前AD沒有較好的治療方法，盡管研究工作增進了對疾病的機制的了解，但對疾病治療仍未有較大突破，這可能是因為一旦發(fā)生認知障礙，就會出現(xiàn)不可逆的神經(jīng)元損傷，因此目前的研究集中在早期發(fā)現(xiàn)和早期干預(yù)[3]。豐富環(huán)境(Enriched Enrichment, EE)可以提供豐富多感官、多運動的刺激，且囊括訓(xùn)練學(xué)習(xí)的鍛煉功能，被認為有益于哺乳動物認知功能改善，可能是治療AD的有效方法。因此本研究擬采用連續(xù)腹腔注射D-半乳糖建立C57/B16小鼠的AD模型，并飼養(yǎng)在豐富環(huán)境下，探究其對AD小鼠行為和神經(jīng)發(fā)生的影響，為AD進一步治療和研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 將30只6個月齡C57/B16雄性小鼠，飼養(yǎng)于皖南醫(yī)學(xué)院動物房，常溫、常濕飼養(yǎng)，動物自由攝取食物和飲水。

1.2 主要實驗儀器與試劑 Morris水迷宮及視頻分析系統(tǒng)(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司)；冰凍切片機(ThermoHM525NX)；激光共聚焦掃描顯微鏡。D-半乳糖(MACKLIN麥克林)；免疫熒光一抗：大鼠抗BrdU，羊抗DCX；二抗：驢抗大鼠594，驢抗羊488；4%多聚甲醛，蔗糖，胎牛血清BSA，PBS漂洗液，甘油封片劑。

1.3 實驗分組 將30只6個月齡的C57/B16雄性小鼠隨機分成三組，其中一組為正常對照組，飼養(yǎng)于標準環(huán)境中；另兩組連續(xù)8周腹腔注射D-半乳糖(120mg/kg)建立AD模型。AD模型小鼠中的一組飼養(yǎng)于特制的豐富環(huán)境中(飼養(yǎng)籠較標準籠大，內(nèi)置若干管道、滾輪、小球玩具等裝置)為豐富環(huán)境組，另一組飼養(yǎng)在標準環(huán)境中設(shè)置為AD對照組。

1.4 曠場行為學(xué)檢測(Open-Field test,OFT) 曠場儀器主要由一個60cm×60cm×45cm的空曠封閉箱子組成，內(nèi)置攝像頭。實驗在昏暗光線下進行，選用30min記錄小鼠曠場行為學(xué)。記錄的參數(shù)包括水平運動次數(shù)、直立次數(shù)和理毛次數(shù)。

1.5 水迷宮行為學(xué)檢測(Morris-Water Maze test,MWM) 水迷宮是一直徑80cm的水池，配備軌跡跟蹤和電腦分析系統(tǒng)。實驗連續(xù)進行7d，由定位航行和空間探索兩部分組成。(1)定位航行—獲得性訓(xùn)練：將小鼠在水迷宮中連續(xù)訓(xùn)練4d，分別從四個象限進入水迷宮，每次實驗間隔5min。若60s內(nèi)小鼠找到平臺且在平臺上保持1s時，系統(tǒng)即停止記錄，否則小鼠由操作者引導(dǎo)到平臺，在平臺上休息10s后再進行下一次實驗。小鼠在四個起始位置找到平臺的平均時間記為逃避潛伏期，評價小鼠學(xué)習(xí)能力。(2)空間探索：第5天撤除水下平臺，將小鼠遠離原先的平臺象限面向池壁放入水池，統(tǒng)計60s內(nèi)小鼠穿越平臺原先位點的次數(shù)、目標象限的游泳時間和游泳距離的百分比，評價小鼠記憶能力。(3)定位航行—反向空間：第6～7天，將平臺放置于原先平臺的對側(cè)象限，對小鼠進行獲得性訓(xùn)練。檢測方法同獲得性階段，用于評價小鼠學(xué)習(xí)能力精確度。

1.6 免疫熒光檢測 小鼠連續(xù)5d腹腔注射BrdU(50mg/kg, Sigma-Aldrich)。第一次接種BrdU 2d后進行新增殖細胞BrdU+檢測；第7天檢測新分化神經(jīng)元BrdU+/DCX+檢測。小鼠經(jīng)10%水合氯醛深度麻醉，順序灌注生理鹽水和4%多聚甲醛，取出腦組織，用冰凍切片機(ThermoHM525NX)自腦冠狀面切成40μm厚的漂片。從一個隨機切片開始選取腦片，且涵蓋整個海馬生理結(jié)構(gòu)。腦片用0.01M PBS漂洗后，用含0.25% Triton X-100的1%BSA于37℃水浴封閉30min，一抗孵育2h后4℃過夜，PBS漂洗3次后用二抗孵育2h，再漂洗3次，將腦片裱于防脫載玻片上，甘油/PBS(1∶1)封片劑封片，待激光共聚焦掃描顯微鏡拍照。

2 結(jié)果

2.1 曠場行為學(xué)檢測結(jié)果 小鼠經(jīng)豐富環(huán)境連續(xù)飼養(yǎng)8周后，結(jié)果如圖1所示。與對照組相比，AD組的水平運動次數(shù)、直立次數(shù)和理毛次數(shù)均顯著減少，而經(jīng)豐富環(huán)境飼養(yǎng)后的AD小鼠水平運動次數(shù)、直立次數(shù)和理毛次數(shù)均得到顯著提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 水迷宮行為學(xué)檢測結(jié)果 小鼠經(jīng)豐富環(huán)境連續(xù)飼養(yǎng)8周后，結(jié)果如圖2所示。與對照組相比，AD組逃避潛伏期顯著提升，穿平臺次數(shù)、目標象限時間百分比、目標象限距離百分比顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而經(jīng)豐富環(huán)境飼養(yǎng)后的AD小鼠，逃避潛伏期顯著降低，穿平臺次數(shù)、目標象限時間百分比、目標象限距離百分比顯著提升，且與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。

圖1 EE連續(xù)飼養(yǎng)8周后，實驗組與對照組曠場行為結(jié)果

注：A.與對照組相比，AD組水平運動次數(shù)顯著降低(**P<0.01)，與AD組相比，EE+AD組水平運動次數(shù)顯著提高(#P<0.05)； B. 與對照組相比，AD組直立次數(shù)顯著降低(*P<0.05)，與AD組相比，EE+AD組直立次數(shù)顯著提高(#P<0.05)； C.與對照組相比，AD組理毛次數(shù)顯著降低(*P<0.05)，與AD組相比，EE+AD組理毛次數(shù)顯著提高(#P<0.05)。

圖2 EE連續(xù)飼養(yǎng)8周后，實驗組與對照組水迷宮結(jié)果

注：A.與對照組相比，AD組逃避潛伏期明顯升高(*P<0.05)，EE+AD組逃避潛伏期無顯著差異(P>0.05)； B.與對照組相比，AD組穿平臺次數(shù)顯著降低(*P<0.05)，EE+AD組穿平臺次數(shù)無顯著差異(P>0.05);C.與對照組相比，AD組目標象限時間百分比顯著降低(*P<0.05)，EE+AD組目標象限時間百分比無顯著差異(P>0.05)；D.與對照組相比，AD組目標象限距離百分比顯著降低(*P<0.05)，EE+AD組目標象限距離百分比無顯著差異(P>0.05)。

2.3 小鼠海馬區(qū)免疫熒光表達結(jié)果 小鼠經(jīng)豐富環(huán)境連續(xù)飼養(yǎng)8周后，與對照相比，AD小鼠海馬區(qū)BrdU陽性細胞和BrdU/DCX雙標陽性細胞顯著降低。而與飼養(yǎng)在普通環(huán)境的AD小鼠相比，飼養(yǎng)在豐富環(huán)境下的AD小鼠海馬區(qū)BrdU陽性細胞和BrdU/DCX雙標陽性細胞顯著提升，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 EE連續(xù)飼養(yǎng)8周后，小鼠海馬區(qū)BrdU+及BrdU+/DCX+表達情況

注：A.對照組海馬區(qū)BrdU+細胞分布；B. AD組海馬區(qū)BrdU+細胞分布；C. AD+EE組海馬區(qū)BrdU+細胞分布；D.與對照組相比，AD組海馬區(qū)BrdU+細胞數(shù)顯著降低(*P<0.05)，與AD組相比，AD+EE組BrdU+細胞數(shù)顯著提升(#P<0.05)；E.對照組海馬區(qū)BrdU+/DCX+細胞廣泛分布；F.AD組海馬區(qū)BrdU+/DCX+細胞分布；G.AD+EE組海馬區(qū)BrdU+/DCX+雙標細胞分布；H.與對照組相比，AD組BrdU+/DCX+細胞數(shù)顯著降低(**P<0.01),與AD組相比，AD+EE組BrdU+/DCX+細胞數(shù)顯著提升(#P<0.05)。

3 討論

AD的首要癥狀是記憶力衰退，隨著疾病進展，會出現(xiàn)認知障礙[4]，嚴重影響日常生活。目前，治療AD的一線藥物膽堿酯酶抑制藥和美金剛雖有一定療效，但不良反應(yīng)多。干細胞療法雖然在動物研究中表現(xiàn)出較好的治療AD的潛力，但是臨床應(yīng)用受限，還會增加額外風險[5]。豐富環(huán)境是由多種無生命物和社會刺激組成的復(fù)合體。大量動物行為學(xué)研究表明豐富環(huán)境飼養(yǎng)的AD小鼠表現(xiàn)出較強的活動能力和較好的學(xué)習(xí)記憶能力，說明其可以改善AD小鼠的行為[6]。豐富環(huán)境還可通過增加腦內(nèi)可塑性相關(guān)因子表達，促進大腦海馬神經(jīng)發(fā)生。Mirochnic等[7]通過動物模型證實豐富環(huán)境可增加小鼠海馬齒狀回(DG)與學(xué)習(xí)記憶和情緒調(diào)節(jié)有關(guān)的新生顆粒細胞。對其他神經(jīng)退行性疾病，如在帕金森病模型小鼠中，發(fā)現(xiàn)豐富環(huán)境可改變其黑質(zhì)微環(huán)境，促進膠質(zhì)和神經(jīng)元再生。因其安全、無創(chuàng)等優(yōu)點，現(xiàn)已成為延緩AD病程的一個重要簡便手段。

曠場行為學(xué)是通過動物對新環(huán)境的趨向性來評價動物自發(fā)活動、探索學(xué)習(xí)、焦慮等行為的經(jīng)典方法[8]。實驗結(jié)果表明豐富環(huán)境可以緩解AD小鼠的焦慮癥狀。水迷宮行為學(xué)是與海馬突觸可塑性密切相關(guān)的可靠檢測方法，作為研究AD行為的經(jīng)典實驗廣泛應(yīng)用于嚙齒類動物的空間航行和記憶能力的研究[9]。實驗結(jié)果顯示，豐富環(huán)境能明顯改善AD小鼠的空間記憶和學(xué)習(xí)記憶能力。

神經(jīng)發(fā)生是指成年哺乳動物腦部的神經(jīng)干細胞在適宜環(huán)境下產(chǎn)生新生神經(jīng)細胞的過程。大量研究證實，通過促進新生神經(jīng)元產(chǎn)生，可改善學(xué)習(xí)記憶能力[10]。DCX(doublecortin)是神經(jīng)前體細胞和未成熟神經(jīng)細胞表達的一種微管相關(guān)蛋白，主要在哺乳動物大腦的DG和側(cè)腦室壁中表達很高。本實驗通過BrdU特異性標記具有增殖分化潛能的新生細胞，BrdU/DCX特異性標記新生神經(jīng)元，檢測小鼠海馬區(qū)的神經(jīng)發(fā)生，實驗結(jié)果表明其能促進AD小鼠的神經(jīng)發(fā)生。

綜上所述，豐富環(huán)境可以改善AD小鼠的行為和學(xué)習(xí)記憶能力，促進神經(jīng)發(fā)生，緩解AD癥狀?？紤]到上述結(jié)果，我們推測發(fā)生這一系列改變，可能是由于豐富環(huán)境誘導(dǎo)了更多的神經(jīng)元細胞增殖，神經(jīng)發(fā)生的增多促進了神經(jīng)元突觸間信號傳遞，進一步在小鼠認知功能等行為學(xué)上得到體現(xiàn)。而在這過程中，突觸間的關(guān)鍵信號蛋白如何改變，還有待進一步探究。