楊文文 倪嘉瑤 胡蕊潔 王華忠

（天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

含有反向重復(fù)序列的DNA 屬于一類復(fù)雜的測序模板，目前，基于Sanger 法的常規(guī)測序方案尚不能有效地解決這一問題［1-3］。通過RNA 干擾（RNA interference，RNAi）方法創(chuàng)制基因沉默材料并對(duì)相應(yīng)的表型進(jìn)行鑒定是重要的功能基因組研究策略之一［4-6］。目前主流的RNAi 技術(shù)都需要構(gòu)建靶基因反向重復(fù)序列的表達(dá)載體，進(jìn)而通過轉(zhuǎn)化方法在細(xì)胞中表達(dá)出RNAi 的起始效應(yīng)子——雙鏈RNA。RNAi載體構(gòu)建的正確性至關(guān)重要，最終必須通過DNA 測序進(jìn)行確認(rèn)，這就對(duì)反向重復(fù)DNA 的序列測定帶來了挑戰(zhàn)。

目前，根據(jù)載體的類型和雙鏈RNA 產(chǎn)生方式，在植物中實(shí)現(xiàn)RNAi 的技術(shù)主要包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA（hpRNA）表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化［7］和病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）［8］。hpRNA表達(dá)載體上構(gòu)建有“啟動(dòng)子—靶基因片段反向重復(fù)—終止子”表達(dá)盒，2 個(gè)反向重復(fù)中間間隔有內(nèi)含子效率更高［9］。該類載體能夠在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出含雙鏈結(jié)構(gòu)的hpRNA，經(jīng)加工后誘發(fā)RNAi。VIGS 技術(shù)則是利用RNA 病毒的基因組分子攜帶靶基因片段進(jìn)入細(xì)胞，通過病毒雙鏈RNA 復(fù)制中間體的產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)靶基因片段雙鏈RNA 的生成和RNAi 的誘發(fā)［10-11］。在載體構(gòu)建階段，病毒基因組RNA 通常以cDNA 的形式保存于質(zhì)粒載體上，采用常規(guī)分子克隆技術(shù)將靶基因片段插入到病毒基因組上。病毒的接種可以通過2 種方法實(shí)現(xiàn)，其一是通過體外轉(zhuǎn)錄方法獲得感染性的病毒基因組RNA 用于植物接種［11］；其二是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的稱為agroinfiltration 的方法進(jìn)行植物接種［12］。在VIGS 技術(shù)中，由于靶基因雙鏈RNA的產(chǎn)生是源自病毒的雙鏈RNA 復(fù)制中間體，在病毒基因組上僅插入靶基因的一段正向或反向片段即可實(shí)現(xiàn)基因沉默。但是有研究表明，插入靶基因串聯(lián)反向重復(fù)片段的病毒基因組能夠?qū)崿F(xiàn)更高效的基因沉默［13］。

以上兩類RNAi 載體都要求克隆有靶基因片段的反向重復(fù)。在對(duì)RNAi 載體的正確性進(jìn)行測序驗(yàn)證時(shí)，位置緊鄰的反向重復(fù)序列在測序反應(yīng)中有形成單鏈分子內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)的傾向，影響引物的結(jié)合和DNA 聚合酶的延伸［1-3］。已經(jīng)報(bào)道的解決方案主要圍繞測序反應(yīng)的優(yōu)化進(jìn)行，包括測序反應(yīng)中各成分含量的調(diào)整、特殊添加物的使用、反應(yīng)各步驟溫度和時(shí)間的優(yōu)化等［14-17］。這些方案的技巧性較強(qiáng)，不同序列組成和長度的反向重復(fù)片段形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性不同，需要反復(fù)優(yōu)化測序反應(yīng)，這對(duì)于大多數(shù)自身不具備測序條件而將測序試驗(yàn)完全委托給公司的實(shí)驗(yàn)室而言實(shí)施起來比較困難。

本研究在前期構(gòu)建小麥基因的VIGS 載體過程中也遇到了反向重復(fù)序列的測序問題，為排除測序反應(yīng)中2 個(gè)反向重復(fù)片段之間的干擾，進(jìn)而開發(fā)了一種新的測序前載體處理策略：將反向重復(fù)片段中的一個(gè)切除后對(duì)保留在載體上的另外一個(gè)進(jìn)行測序，經(jīng)過2 次酶切和2 次測序可以有效地對(duì)載體上的2個(gè)反向重復(fù)片段分別進(jìn)行序列測定，進(jìn)而確認(rèn)構(gòu)建載體的正確性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體和試劑 小麥自噬相關(guān)基因TaATG2為天津師范大學(xué)王華忠教授課題組已克隆基因，其全長cDNA 保存于載體上?；诖篼湕l斑病毒BSMV的VIGS 載體BSMVγ1保存于天津師范大學(xué)王華忠教授課題組實(shí)驗(yàn)室。試驗(yàn)用到的高保真DNA 聚合酶primeSTAR、普通Taq 酶、限制性內(nèi)切酶（BamHⅠ、SpeⅠ和SalⅠ）以及大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞均為TakaRa 公司產(chǎn)品；快速連接試劑盒（LigaFast）購自Promega 公司；引物合成委托北京六合華大基因科技有限公司完成；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建 設(shè)計(jì)合成2 條正向引物ATG2-F（5′-CGCGGATCCTCAAGCCTATTGTTCTGCACA-3′，下劃線為BamHⅠ識(shí)別位點(diǎn)）和ATG2-F1（5′-ACG CGTCGACTCAAGCCTATTGTTCTGCAC A-3′， 下 劃線為SalⅠ識(shí)別位點(diǎn)），以及一條反向引物ATG2-R（5′-GGACTAGTAGGATCAAA CTGACGAGGGA-3′，下劃線為SpeⅠ識(shí)別位點(diǎn)）。2 條正向引物分別和同一條反向引物搭配，用于從TaATG2的同一50 bp 區(qū)段擴(kuò)增出BamHⅠ-正向片段-SpeⅠ和SpeⅠ-反向片段-SalⅠ。以含有TaATG2全長cDNA 的質(zhì)粒為模板，使用高保真DNA 聚合酶primeSTAR 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。2 個(gè)擴(kuò)增片段經(jīng)雙酶切后與BamHⅠ/SalⅠ雙酶切切開的載體BSMVγ1同時(shí)進(jìn)行連接，目的是獲得插入串聯(lián)反向重復(fù)片段（BamHⅠ-正向片段-SpeⅠ-反向片段-SalⅠ）的重組載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，使用菌落PCR 方法初步鑒定候選重組載體，對(duì)候選重組載體進(jìn)行DNA 測序驗(yàn)證。

1.2.2 構(gòu)建載體的測序驗(yàn)證 使用2 種質(zhì)粒處理方法對(duì)候選重組載體進(jìn)行測序驗(yàn)證。一種是提取完整載體質(zhì)粒后直接送到公司測序；另一種是對(duì)載體質(zhì)粒首先進(jìn)行酶切處理，切下一個(gè)基因片段后將保留另一個(gè)片段的線性化載體送公司測序，分別完成對(duì)2 個(gè)插入片段的測序。

2 結(jié)果

2.1 小麥TaATG2的VIGS載體構(gòu)建

經(jīng)PCR 擴(kuò)增獲得TaATG2一個(gè)50 bp 區(qū)段的2 個(gè)片段BamHⅠ- 正向片 段-SpeⅠ（圖1-A）和SpeⅠ-反向片段-SalⅠ（圖1-B）。將雙酶切后的2 個(gè)片段與載體BSMVγ1同時(shí)進(jìn)行連接，獲得插入TaATG2串聯(lián)反向重復(fù)片段的VIGS 載體pBSMVATG2（圖1-B）。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后采用菌落PCR 法初步篩選重組克隆，菌落PCR 使用的引物P1 和P2 的識(shí)別位點(diǎn)位于載體上的插入位點(diǎn)兩側(cè)（圖1-B）。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，挑選擴(kuò)增出約500 bp（394 bp 載體序列+106 bp 串聯(lián)反向重復(fù)片段和中間SpeⅠ切點(diǎn)）大小片段的菌落克?。▓D1-C中的箭頭所示泳道）作為候選克隆進(jìn)行下一步的測序驗(yàn)證。

在菌落PCR 的電泳中還發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物大于500 bp 的情況（圖1-C 中的非箭頭所示泳道），推測是載體上同時(shí)插入了4 個(gè)或更多片段所致。這種情況產(chǎn)生的原因可能是連接反應(yīng)中分子量較小的基因擴(kuò)增片段相對(duì)濃度較高，從而容易導(dǎo)致多個(gè)片段串聯(lián)插入到載體上。

圖1 TaATG2 的VIGS 載體構(gòu)建

2.2 完整質(zhì)粒上的兩個(gè)串聯(lián)反向重復(fù)片段同時(shí) 測序

為了驗(yàn)證構(gòu)建載體的正確性，以提取的完整環(huán)狀質(zhì)粒為模板、使用載體上插入位點(diǎn)一側(cè)的P2 引物向插入位點(diǎn)方向進(jìn)行測序（圖2-A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，插入位點(diǎn)之前的載體序列部分測序信號(hào)正常，但進(jìn)入SalⅠ位點(diǎn)后僅能正常測出反向片段的前20 bp 左右的序列，之后的測序信號(hào)呈現(xiàn)套峰（圖2-B）或迅速衰減（圖2-C）。更換測序公司或優(yōu)化測序反應(yīng)均無法解決這一問題，因而制約了對(duì)構(gòu)建載體正確性的確認(rèn)。

2.3 質(zhì)粒的酶切處理和2個(gè)反向重復(fù)片段的分別 測序

圖2 以完整質(zhì)粒為模板的串聯(lián)反向重復(fù)片段的測序

完整質(zhì)粒測序失敗的原因可能是正、反向片段在載體上有形成單鏈內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的傾向，為此設(shè)計(jì)了一個(gè)新的測序方案：酶切切除反向重復(fù)片段中的一個(gè)后對(duì)線性化載體上的另外一個(gè)進(jìn)行測序。新方案的測序結(jié)果表明，保留在載體上的正向片段（圖3-A）或反向片段（圖3-B）均能得到清晰的測序信號(hào)和正確的測序結(jié)果。測序信號(hào)通過目的片段到達(dá)線性化載體的末端后迅速衰減。末端序列為ACTAGA，其中ACTAG 是SpeⅠ的粘性末端，最末端的A 是由測序反應(yīng)中使用的Taq 類聚合酶添加（圖3）。新方案對(duì)正、反向片段的測序結(jié)果證明了構(gòu)建載體的正確性。

3 討論

載體構(gòu)建是操縱基因表達(dá)或沉默的重要環(huán)節(jié)之一。過去一段時(shí)間，通過酶切、連接方法構(gòu)建的載體一般通過酶切獲得插入片段的方法進(jìn)行正確性驗(yàn)證。但是經(jīng)酶切驗(yàn)證的載體仍然可能存在錯(cuò)誤，如來自PCR 擴(kuò)增的插入片段可能是或混有大小相近的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物、PCR 過程引入了序列突變、多個(gè)載體同時(shí)構(gòu)建時(shí)不同插入片段的交叉污染以及構(gòu)建載體的交叉污染或人為混淆等。這些錯(cuò)誤如得不到發(fā)現(xiàn)會(huì)使后續(xù)的基因表達(dá)或沉默試驗(yàn)得不到正確的結(jié)論，也浪費(fèi)了時(shí)間、人力和物力。近年來隨著DNA 測序成本的下降，構(gòu)建的載體最終都要通過測序來確保準(zhǔn)確。開展hpRNA 表達(dá)或VIGS 等RNAi試驗(yàn)都需要構(gòu)建能夠表達(dá)靶基因反向重復(fù)片段的載體［7，13］。此類載體上的反向重復(fù)片段，特別是串聯(lián)反向重復(fù)片段的直接測序目前還是Sanger 測序法應(yīng)用上的難點(diǎn)［1-3］。本研究也證實(shí)了這一困難的存在，對(duì)串聯(lián)反向重復(fù)片段進(jìn)行測序時(shí)因模板二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成導(dǎo)致測序信號(hào)出現(xiàn)亂峰或衰減。為了解決這一困難，本研究嘗試了將反向重復(fù)片段中的一個(gè)切除后對(duì)保留在載體上的另外一個(gè)進(jìn)行測序的方案，發(fā)現(xiàn)該方案確實(shí)可以有效地實(shí)現(xiàn)對(duì)2 個(gè)重復(fù)片段的序列測定，進(jìn)而確認(rèn)構(gòu)建載體的正確性。

也有報(bào)道采用在載體上的2 個(gè)反向重復(fù)片段之間進(jìn)行酶切后測序的方法，酶切后的2 個(gè)片段分別位于線性化載體的2 個(gè)末端［1-2］。本研究也嘗試了這一方法，但目的片段部分的測序信號(hào)雜峰較嚴(yán)重，序列可讀性差。這種方法的可行性可能與插入片段的序列組成及長度，以及載體的大小（影響酶切后2 個(gè)位于末端的反向重復(fù)之間的距離和形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的難易）有關(guān)。

近幾年的載體構(gòu)建工作中，Gibson assembly、LIC（ligation-independent cloning） 和Gateway 等 幾種不依賴于酶切、連接的無縫克隆方法也逐漸被采用［18-20］。鑒于反向重復(fù)片段在直接測序上的困難，在使用這幾種方法構(gòu)建RNAi 載體時(shí)建議在插入的反向重復(fù)片段兩端和中間引入適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)，以便采用本研究開發(fā)的策略對(duì)正、反向片段分別測序，實(shí)現(xiàn)對(duì)所構(gòu)建載體正確性的準(zhǔn)確判斷。

圖3 酶切切除載體上反向重復(fù)片段中的一個(gè)后對(duì)另外一個(gè)進(jìn)行測序

4 結(jié)論

開發(fā)了一個(gè)有效的RNAi 載體上的反向重復(fù)片段測序策略：切除一個(gè)片段后對(duì)保留的另外一個(gè)進(jìn)行測序，經(jīng)過2 次酶切和2 次測序可以有效地對(duì)2個(gè)反向重復(fù)片段分別進(jìn)行序列測定，進(jìn)而確認(rèn)構(gòu)建載體的正確性。