潘 姝，文丹寧，李華東

(武漢市金銀潭醫(yī)院 感染科, 湖北 武漢 430000)

肺泡上皮細(xì)胞位于肺泡表面，是抵御外界病原體的重要屏障，與肺部疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)[1]。肺泡上皮細(xì)胞凋亡可破壞肺上皮細(xì)胞的完整性，促進(jìn)急性肺損傷發(fā)生；而抑制其凋亡在改善急性肺損傷方面發(fā)揮著積極作用[2]。因此，探討肺泡細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，尋找抑制其凋亡的有效靶點對改善急性肺損傷具有重要意義。微小RNA(miRNA)是廣泛存在于真核生物體中的短鏈非編碼RNA，通過與靶基因特異性結(jié)合抑制其表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用。miR-29b是一種與肺癌、肺纖維化和肺炎等肺相關(guān)疾病密切相關(guān)的miRNA[3-5]，但其在肺泡上皮細(xì)胞凋亡中的作用并不完全清楚。細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是構(gòu)成革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的主要成分，可誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡，引起急性肺損傷[6]。本研究以肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549為研究對象，觀察miR-29b對LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡的影響，并探討其可能的分子機(jī)制，以闡明miR-29b在肺泡上皮細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑

人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞系A(chǔ)549(中科院上海細(xì)胞庫)，LPS(Sigma-Aldrich公司)；GAPDH、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3抗體(Cell Signal Technology公司)； Lipofectamine 2000和Trizol試劑(Invitrogen公司)；胰蛋白酶、胎牛血清和高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)； RIPA裂解液、熒光素酶報告基因檢測試劑盒、annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和BCA蛋白檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；MTT試劑、辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗和RT-qPCR試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；PCR引物序列(上海生工生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)、分組與處理： 使用高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)在5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)A549細(xì)胞，定期(每2 d)換液，待細(xì)胞匯合度達(dá)85 %左右時，以胰蛋白酶消化并按照1∶3比例傳代培養(yǎng)。將良好的第4代增殖期的A549細(xì)胞接種至細(xì)胞板上，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞分為1)對照組：未處理；2)LPS組：給予10 mg/L的LPS處理24 h[7]；3)LPS+miR-NC組：轉(zhuǎn)染miR-29b mimics陰性對照后給予10 mg/L的LPS處理24 h；4)LPS+miR-29b組：轉(zhuǎn)染miR-29b mimics 后給予10 mg/L的LPS處理24 h。待細(xì)胞匯合度達(dá)75 %左右時，參照Lipofectamine 2000說明書步驟將miR-29b mimics及其陰性對照根據(jù)上述分組轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h后，給予LPS處理。孵育24 h后，采用RT-qPCR檢測各組細(xì)胞中miR-29b的表達(dá)水平以評價轉(zhuǎn)染效果。

1.2.2 RT-qPCR檢測miR-29b的表達(dá)：用Trizol法提取A549細(xì)胞總RNA，運用紫外分光光度計檢測總RNA的濃度。根據(jù)RT-qPCR試劑盒說明書步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，在以cDNA為模板，配制20 μL的反應(yīng)體系，按照設(shè)定的反應(yīng)程序(95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性40 s、58 ℃ 退火40 s、72 ℃延伸 40 s，38個循環(huán))上PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。以U6為內(nèi)參，運用2-△△Ct法比較各組細(xì)胞中miR-29b表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞存活率：將A549細(xì)胞以每孔100 μL(3×105個/mL)接種至96孔細(xì)胞板上，在培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)過夜。處理結(jié)束后，加入20 μL/孔 MTT溶液(5 g/L)孵育4 h。棄上清后，加入150 μL/孔二甲基亞楓振蕩反應(yīng)至結(jié)晶溶解。采用酶標(biāo)儀在570 nm波長處檢測各組細(xì)胞的吸光度值，并根據(jù)公式：存活率(%)=(處理組吸光度值-空白組吸光度值)/(對照組吸光度值-空白組吸光度值)×100%計算出各組細(xì)胞的存活率。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率：采用0.25%胰蛋白酶消化1.2中處理結(jié)束后的細(xì)胞，使用磷酸緩沖液洗滌兩遍后，加入500 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，再依次加入annexin V-FITC 和PI工作液各5 μL，充分混勻后，于室溫避光條件下反應(yīng)10 min。60 min內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot檢測Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)：使用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，并以BCA法定量總蛋白的濃度與純度。將蛋白樣品與等體積的上樣緩沖液混勻后，置于沸水浴中變性5 min。以60 μg/孔上樣至12% SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳，結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜。使用5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶800)、次leaved caspase-3(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)一抗工作液在4℃下孵育24 h。經(jīng)TBST緩沖液洗滌15 min×3次后，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗工作液(1∶2 000)于室溫下孵育1 h。滴加ECL化學(xué)發(fā)光劑于暗室內(nèi)顯影曝光后，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析目的蛋白條帶的吸光度值，并以目的條帶吸光度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶的吸光度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒悍謩e構(gòu)建含Bax 3′UTR野生結(jié)構(gòu)(野生型Bax-WT)和Bax 3′UTR突變結(jié)構(gòu)(突變型Bax-MUT)的Bax 3′UTR 熒光素酶報告載體。將A549細(xì)胞以適當(dāng)密度接種至6孔細(xì)胞板上后，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至70%匯合度時，參照Lipofectamine 2000說明書步驟將miR-29b mimics及其陰性對照分別與Bax-WT、Bax-MUT進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，并標(biāo)記為miR-29b+Bax-WT組和miR-29b+Bax-MUT組、miR-NC+Bax-WT組和miR-NC+Bax-MUT組。轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞，參照熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書步驟檢測其熒光素酶活性。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中miR-29b表達(dá)升高

給予LPS處理的LPS組、LPS+miR-NC組和LPS+miR-29b組細(xì)胞中miR-29b的表達(dá)水平較對照組明顯降低(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+miR-29b組細(xì)胞中miR-29b的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)(表1)。

*P<0.05 compared with the control group;#P<0.05 compared with LPS group.

2.2 miR-29b過表達(dá)對A549細(xì)胞活力的影響

與對照組相比，LPS組、LPS+miR-NC組和LPS+miR-29b組中細(xì)胞存活率均明顯降低(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+miR-29b組細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.05)(表2)。

表2 各組細(xì)胞的存活率和凋亡率

*P<0.05 compared with the control group;#P<0.05 compared with LPS group.

2.3 miR-29b過表達(dá)對A549細(xì)胞凋亡的影響

與對照組相比，其余3組細(xì)胞凋亡率均明顯升高(P<0.05)；LPS+miR-29b組細(xì)胞凋亡率較LPS組明顯降低(P<0.05)(圖1,表2)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況Fig 1 Apoptosis in each group was detected by flow cytometry

2.4 miR-29b過表達(dá)對A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，LPS組、LPS+miR-NC組和LPS+miR-29b組細(xì)胞中Bax和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平明顯升高，而Bcl-2蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+miR-29b組細(xì)胞中Bax和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平明顯低于LPS組，而Bcl-2蛋白的表達(dá)水平明顯高于LPS組(P<0.05)(圖2,表3)。

圖2 Western blot檢測Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)Fig 2 Expression of Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3 proteins were detected by Western blot

2.5 miR-29b靶基因的預(yù)測及其驗證

采用TargetScan(http://www.targetscan.org/)、miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)及miRBase(http://mirbase.org/)三大數(shù)據(jù)庫預(yù)測到Bax 3′UTR 與miR-29b存在互補(bǔ)的核苷酸序列(表4)。采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測得到：miR-29b+Bax-WT組細(xì)胞的熒光素酶活性較miR-NC+Bax-WT組明顯降低(P<0.05)(表5)。

3 討論

miR-29b可通過TGF-β/Smad信號通路抑制肺間質(zhì)纖維化過程[4]。miR-29b的表達(dá)與支氣管肺發(fā)育不良嚴(yán)重程度相關(guān)，可通過降低母體炎性反應(yīng)和新生兒高氧血癥小鼠的基質(zhì)蛋白表達(dá)改善肺泡極化，與急性肺損傷和肺纖維化關(guān)系密切[8]。在H2O2誘導(dǎo)的高氧性急性肺損傷模型中，在篩選肺泡上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)miRNA時發(fā)現(xiàn)miR-29b表達(dá)明顯降低[9]，但miR-29b在肺泡上皮細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用及其機(jī)制尚不明確。

表3 各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平

*P<0.05 compared with the control group;#P<0.05 compared with LPS group.

表4 Bax 3′UTR 與miR-29b的結(jié)合位點Table 4 Binding sites of Bax 3′UTR to miR-29b

表5 各組細(xì)胞的熒光素酶活性

*P<0.05 compared with miR-NC+Bax-WT group.

本研究用LPS處理后發(fā)現(xiàn)，肺泡上皮細(xì)胞A549存活率降低，凋亡率升高，同時細(xì)胞中抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平降低，而促凋亡蛋白Bax和Cleaved caspase-3的表達(dá)水平升高，表明LPS可通過調(diào)控Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡。此外，LPS可引起A549細(xì)胞中miR-29b表達(dá)降低。該結(jié)果與報道[10]的在LPS誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究中發(fā)現(xiàn)LPS可下調(diào)miR-29b表達(dá)的結(jié)果相似。提示，miR-29b可能在LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。

miR-29b可通過抑制成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞N2a凋亡減輕糖剝奪/再灌注損傷[11]。miR-29b可通過調(diào)控SP1表達(dá)在白藜蘆醇抗糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著積極作用[12]。本研究成功上調(diào)A549細(xì)胞中miR-29b的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，LPS刺激的A549細(xì)胞存活率和Bcl-2蛋白的表達(dá)升高，凋亡率和Bax、Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)降低。提示miR-29b可抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡。

采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-29b的潛在靶基因，最終將Bax作為研究對象。Bax是公認(rèn)的促凋亡基因，屬于Bcl-2家族成員，其編碼的蛋白可與Bcl-2形成異二聚體抑制Bcl-2的作用，進(jìn)而在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著促進(jìn)作用。在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷肺組織中Bax的表達(dá)升高[13]，沉默Bax表達(dá)可逆轉(zhuǎn)TNF-α誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡[14]。采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實Bax是miR-29b的靶基因；上調(diào)miR-29b表達(dá)后，A549細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)水平降低。miR-29b通過直接靶向Bax抑制阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[15]。這提示，miR-29b可能通過靶向調(diào)控Bax表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷。

總之，miR-29b可抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549凋亡，其作用機(jī)制可能與靶向調(diào)控Bax表達(dá)有關(guān)。