徐蘇晴， 常 明， 宓蘭蘭， 蔡佳玉， 薛正陽， 盧紅艷

（江蘇大學附屬醫(yī)院兒科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

中性粒細胞在機體對抗病原的先天免疫中起著關鍵作用。Brinkman等［1］于2004年發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞在細胞外產(chǎn)生一種由組蛋白、DNA和蛋白酶組成的網(wǎng)狀結構，即中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）。NETs是以DNA為骨架、其間鑲嵌多種蛋白成分的DNA-蛋白質(zhì)復合物，蛋白成分主要是瓜氨酸化組蛋白H3（citrullinated histone H3，CitH3），其次是髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、粒狀酶和多肽，其具有促炎及細胞毒作用［2］。生物體或病原體產(chǎn)生的各種生物分子均可誘導中性粒細胞活化，產(chǎn)生 NETs［3］。在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的急性肺損傷（acute lung injury，ALI）成年小鼠模型中，研究者發(fā)現(xiàn)小鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）及血漿中NETs水平均增高，使用NETs抑制劑脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）后，小鼠ALI癥狀得到緩解，提示NETs的產(chǎn)生可造成肺組織損傷［4］。新生兒急性肺損傷為新生兒危重癥，其嚴重形式表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征，是由多種原因引起的肺部彌漫性損傷。NETs及其組成成分是否加重新生大鼠ALI癥狀，目前并不清楚。本文擬通過分析新生SD大鼠ALI模型中BALF及肺組織中NETs的含量及結構，探討NETs在新生大鼠急性ALI中的作用。

材料與方法

1 材料

1.1 實驗動物 30只7日齡的新生SD大鼠購自江蘇大學實驗動物中心，許可證號為SYXK（蘇）2018-0053。

1.2 實驗材料 LPS和小牛胸腺DNA購自Sigma；Sytox Green購自Invitrogen；兔來源抗CitH3抗體購自Abcam；山羊來源抗MPO抗體購自R&D；Alexa Fluor 488驢抗兔熒光抗體、Alexa Fluor 594驢抗山羊熒光抗體和DAPI染料購自上海翊圣生物科技有限公司；SDS-PAGE凝膠制備盒試劑購自北京康為世紀生物科技有限公司；抗GAPDH抗體購自蘇州睿瀛生物技術有限公司；HRP標記的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG和兔抗羊IgG購自Immunoway；大鼠白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 實驗動物分組及處理 出生7 d的SD新生大鼠30只，按照隨機數(shù)字表法分成生理鹽水對照組（control組）、ALI組及ALI+Dnase組，每組10只。ALI組用LPS以20 mg/kg的劑量腹腔注射建立新生大鼠ALI模型，ALI+Dnase組則在注射LPS后即腹腔注射Dnase（5 mg/kg）。給藥6 h后，使用水合氯醛麻醉新生鼠，收集BALF，使用左肺組織制備組織勻漿液，右肺組織固定于4%多聚甲醛中。

2.2 檢測BALF中游離DNA（cell-free DNA，cf-DNA） 使用綠色熒光染料Sytox Green對新生大鼠BALF中的cf-DNA進行檢測。Sytox Green∶PBS=1∶5 000進行稀釋，配制1 000μg/L、500μg/L、250μg/L、125μg/L、62.5μg/L、10μg/L和0μg/L的小牛胸腺DNA做標準品，將BALF標本和不同濃度濃度梯度的標準品以每孔100μL的量加入相應孔中。避光條件下向每孔中加入100μL的稀釋后Sytox Green，輕輕震蕩10 s使其與染料混勻，即刻用熒光酶標儀在485 nm波長下測量各個樣本和標準品的熒光強度。

2.3 HE染色觀察肺組織形態(tài)結構 將取材完畢后的右肺組織置入4%多聚甲醛溶液中固定，48 h后進行脫水浸蠟、石蠟包埋并制作厚4.5μm切片，光鏡下觀察HE染色肺組織形態(tài)及結構改變。光鏡下觀察肺組織病理學變化并進行評分。評分標準如下［5］：對肺泡充血、出血、肺泡腔或血管壁中性粒細胞浸潤或聚集、肺泡壁增厚和（或）透明膜形成4項指標，分別依病變輕重評0～4分（0：無病變或非常輕微；1：輕度病變；2：中度病變；3：重度病變；4：極重度病變）。各項評定分數(shù)相加為各組肺組織損傷總評分。

2.4 免疫熒光法檢測肺組織中CitH3及MPO的水平 留取的肺組織制備成石蠟切片，脫蠟后用抗原修復液進行修復，PBS洗3次，3%BSA封閉1 h，抗CitH3抗體（1∶200）4℃孵育過夜，PBS洗3次，加入Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594抗體室溫孵育 1 h，PBS洗3次，DAPI染核10 min，PBS清洗后防淬滅封片劑封片，免疫熒光顯微鏡觀察。

2.5 Western blot檢測肺組織中CitH3及MPO的水平 將不同組中新生鼠肺組織剪碎后按照每20 mg加入200μL RIPA提取蛋白。按每泳道10μL上樣至12%梯度膠進行電泳，轉(zhuǎn)膜2 h將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉1 h，I抗按照1∶2 000比例4℃孵育過夜。TBST洗膜后II抗孵育1 h，用凝膠分析成像系統(tǒng)掃描并進行半定量分析，目的蛋白相對表達量=目的蛋白吸光度/內(nèi)參照吸光度。

2.6 ELISA檢測肺組織勻漿液中IL-6和TNF-α的含量 將肺組織按照1 g組織樣品加入9 mL預冷PBS的方法，經(jīng)剪碎、研磨、離心等步驟制備組織勻漿液。加樣前使用BCA方法測定蛋白濃度。按照試劑盒說明書步驟經(jīng)加樣、孵育、洗滌、顯色、終止等步驟后，立即用酶標儀在450 nm波長測量各孔的吸光度。

3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤（mean±SEM）表示，使用GraphPad Prism 7.0軟件通過單因素方差分析進行統(tǒng)計學分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 BALF中cf-DNA含量

與對照組相比，ALI組與ALI+Dnase組BALF中cf-DNA均升高（P＜0.05）；ALI+Dnase組BALF中cf-DNA較ALI組降低（P＜0.05），見圖1。這說明與對照組相比，ALI組中NETs水平增高，使用Dnase后NETs水平降低。

Figure 1.The levels of cf-DNA in BALFof different groups measured by fluorescence microplate.Mean±SEM.n=10.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs ALIgroup.圖1 BALF中cf-DNA含量的變化

2 肺組織形態(tài)結構

HE染色結果可見，對照組大鼠肺泡結構和氣道黏膜上皮完整，支氣管和血管周圍未見明顯炎癥細胞浸潤；ALI組新生大鼠肺組織有肺毛細血管通透性增高，肺部水腫，氣管內(nèi)和血管周圍可見炎癥細胞廣泛浸潤，以嗜中性細胞增多為主；ALI+Dnase組新生大鼠的肺組織病變明顯減輕，支氣管和血管周圍炎癥細胞浸潤明顯減少，氣道黏膜充血水腫減輕，見圖2。肺損傷評分顯示，與對照組相比，ALI組肺損傷嚴重（P＜0.05），ALI+Dnase組較ALI組肺部損傷情況緩解（P＜0.05），見圖3。

Figure 2.HE staining of lung tissues in the rats of each group（×200）.圖2 肺組織HE染色結果

Figure 3.The results of lung histopathological injury scoring.Mean±SEM.n=5.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs ALIgroup.圖3 肺組織病理學損傷評分結果

3 各組大鼠肺組織中CitH3及MPO免疫熒光染色

熒光顯微鏡下，ALI組與ALI+Dnase組大鼠肺組織中均可見綠色熒光免疫反應陽性產(chǎn)物CitH3及紅色熒光免疫反應陽性產(chǎn)物MPO，且其產(chǎn)生水平均高于對照組（P＜0.05）；ALI+Dnase組的肺組織中CitH3及MPO較ALI組降低（P＜0.05），見圖4。這說明ALI新生大鼠肺組織中NETs水平增高，而Dnase可降低NETs水平。

4 各組大鼠肺組織中CitH3及MPO蛋白表達水平

Western blot結果顯示，與對照組相比，ALI組與ALI+Dnase組的肺組織中CitH3及MPO均升高（P＜0.05）；ALI+Dnase組的肺組織中CitH3及MPO較ALI組降低（P＜0.05），見圖5。這說明Dnase可降低ALI新生大鼠肺組織中的NETs水平。

5 肺組織勻漿中IL-6和TNF-α含量的變化

與對照組相比，ALI組與ALI+Dnase組的肺組織勻漿中IL-6及TNF-α的含量均升高（P＜0.05）；ALI+Dnase組的肺組織勻漿中IL-6及TNF-α的含量較ALI組降低（P＜0.05），見圖6。

討 論

ALI是肺部急性彌漫性炎癥，在新生兒重癥監(jiān)護室中較常見，多種因素均可導致ALI發(fā)生。在ALI過程中，肺泡毛細血管屏障功能受損，滲出的富含蛋白質(zhì)的液體進入肺泡，形成水腫和透明膜，導致急性呼吸衰竭。ALI發(fā)病過程較為復雜，其發(fā)病機制至今未得到完全闡明。目前認為新生兒ALI發(fā)生、發(fā)展與中性粒細胞有密切聯(lián)系。

Figure 4.Immunofluorescence staining for CitH3（green）and MPO（red）in the lung tissues（×200）.The nucleus was stained by DAPI（blue）.Merged images showed NETs（orange）.The bar chart showed the area of NETs.Mean±SEM.n=5.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs ALIgroup.圖4 肺組織中CitH3及MPO免疫熒光染色觀察

Figure 6.The levels of IL-6 and TNF-α in the lung tissue homogenate of different groups measured by ELISA.Mean±SEM.n=5.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs ALIgroup.圖6 肺組織勻漿中IL-6和TNF-α含量的變化

NETs是由中性粒細胞釋放的以DNA為骨架、多種蛋白質(zhì)鑲嵌其中的復合物質(zhì)，其中主要致病物質(zhì)為CitH3、MPO等多種蛋白質(zhì)成分。BALF中的DNA水平可反映NETs的生成水平。有研究者在LPS誘導的成年小鼠ALI模型中，發(fā)現(xiàn)小鼠BALF中DNA含量明顯增加，而DNase可在胞外降解NETs中的DNA，在使用DNase后，BALF中DNA含量明顯降低，疾病癥狀減輕，提示在成年ALI小鼠模型中，BALF中較高水平的NETs對肺組織有損傷作用，且NETs水平可反映疾病嚴重程度［4］。在ALI患者BALF中，與對照組相比，其NETs水平也呈增高趨勢［6］。在本研究中，與對照組相比，ALI組BALF中NETs水平升高，且肺組織中炎癥浸潤程度明顯，提示NETs對肺組織有損傷作用；而在注射DNase后，BALF中NETs水平降低，且肺組織中炎癥浸潤程度較ALI組有所好轉(zhuǎn)，提示在降低了NETs后，肺組織炎癥浸潤程度有所減輕。

CitH3為NETs的組成成分，CitH3的生成水平可反映NETs產(chǎn)生水平。中性粒細胞組蛋白的翻譯后修飾在調(diào)節(jié)中性粒細胞死亡中起著關鍵作用［7］。組蛋白瓜氨酸化可促進不依賴于NADPH氧化酶的NETs形成［8］。組蛋白在體內(nèi)外均可對上皮細胞產(chǎn)生細胞毒性作用，加重ALI癥狀［9］。MPO為NETs的重要組成部分，且其對上皮細胞與內(nèi)皮細胞均有毒性作用［10］，檢測其含量也可反映NETs生成水平。在成年ALI小鼠模型中，研究者利用免疫熒光技術，發(fā)現(xiàn)在肺組織中可見CitH3及MPO水平較對照組明顯增加。在本研究中，與對照組相比，ALI組肺組織中的NETs水平升高，且肺組織炎癥浸潤情況嚴重，這可能是NETs中的組蛋白、MPO等成分對肺組織的損傷造成的。當注射DNase后新生ALI小鼠肺組織中NETs水平降低，即組蛋白、MPO等物質(zhì)生成減少，從而減輕肺部損傷。DNase導致了CitH3和MPO水平的下降，但只是部分地，而不是完全地減少了NETs的產(chǎn)生，這是因為DNase處理NETs時可能促進巨噬細胞的清除作用，從而降低了CitH3和MPO水平［11］。

IL-6是引起ALI炎癥級聯(lián)反應的關鍵炎癥因子，主要由T細胞、單核細胞-巨噬細胞和內(nèi)皮細胞分泌［12］。此外，它還激活中性粒細胞，介導肝臟大量急性期蛋白的分泌，最終促進急性炎癥反應。在創(chuàng)傷、感染發(fā)生時，巨噬細胞被激活，產(chǎn)生和釋放大量TNF-α。TNF-α會損傷血管內(nèi)皮，摧毀其屏障功能，并導致毛細血管通透性增加，大量液體滲出，形成肺水腫，因此導致 ALI［13］。與此同時，在整個 ALI疾病過程中，TNF-α可以減少機體產(chǎn)生的抗氧化物質(zhì)，導致氧自由基的清除減少，從而加重組織損傷，并導致疾病惡化［14］。有研究表明，在新生兒ALI過程中，TNF-α和IL-6與ALI嚴重程度及預后密切相關，TNF-α和IL-6是反映肺損傷的重要指標。對TNF-α和IL-6水平進行動態(tài)監(jiān)測，不僅對ALI早期診斷有意義，也對判斷肺損傷嚴重程度及評價預后具有一定價值［15］。本研究中，ALI組肺組織勻漿中TNF-α和IL-6明顯高于對照組，ALI+Dnase組中肺組織中的TNF-α和IL-6水平較ALI組明顯降低，說明在使用NETs抑制劑Dnase后，新生大鼠肺組織炎性細胞浸潤明顯減少，肺組織病變明顯減輕。

綜上所述，在新生大鼠ALI模型中，NETs水平為反映肺組織損傷的重要指標，NETs抑制劑Dnase可有效減輕肺組織損傷，其作用機制為抑制NETs的組成成分CitH3、MPO等蛋白質(zhì)對組織的損傷。本研究為新生兒ALI的治療提供了新思路。