馬思聰 郝永強(qiáng) 富靈杰

上海市骨科內(nèi)植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院骨科，上海 200011

近年來(lái)，從骨免疫學(xué)及骨微生物學(xué)的新概念證實(shí)了腸道菌群與骨代謝之間的緊密聯(lián)系，干預(yù)與調(diào)節(jié)腸道菌群有望成為預(yù)防和治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的新策略[1-6]。目前，骨質(zhì)疏松癥的腸道菌群結(jié)構(gòu)改變的時(shí)間變化規(guī)律尚不清楚。本研究擬利用去勢(shì)大鼠構(gòu)建I型骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型，利用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)分析比較去勢(shì)前后的腸道菌群的結(jié)構(gòu)變化并提供較為詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為明確骨質(zhì)疏松癥和腸道菌群的發(fā)病聯(lián)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用12周齡雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，共24只，體重228～265 g。由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(SCXK2012-0002)。

1.2 I型骨質(zhì)疏松大鼠動(dòng)物模型建立及糞便腸道菌群收集

SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，每組各6只。去勢(shì)前組的6只大鼠收集骨骼和腸菌樣本。去勢(shì)后4周組、8周組、12周組各6只大鼠采用去勢(shì)法建立I型骨質(zhì)疏松大鼠模型。具體方法是[7]：采用戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉生效后，大鼠放置于俯臥位并固定四肢，腰背部消毒鋪巾。采用胸腰段后背直切口，從雙側(cè)肋脊角進(jìn)入腹腔，依靠局部的脂肪組織辨認(rèn)卵巢，順利結(jié)扎并切除卵巢，同法處理另一側(cè)卵巢組織。最后逐層縫合，關(guān)閉切口。術(shù)后于腹腔內(nèi)注射鎮(zhèn)痛藥和抗生素，大鼠每2只置于單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水，12 h光照周期。

采用DXA法測(cè)量去勢(shì)前組及去勢(shì)12周組的大鼠骨密度BMD，鑒定模型是否構(gòu)建成功。收集去勢(shì)前和去勢(shì)后4周、8周、12周組的腸菌標(biāo)本：采用直接收集法采集大鼠糞便，收集過(guò)程中嚴(yán)格采用無(wú)菌操作。每只大鼠收集0.25～0.45 g，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱。

1.3 16S rRNA高通量腸菌測(cè)序

1.3.1基因組DNA抽提及PCR擴(kuò)增：采用DNA提取試劑盒E.Z.N.A.? Soil DNA Kit (D5625-01)，按照操作說(shuō)明對(duì)每個(gè)大鼠糞菌樣本進(jìn)行DNA提取。首先，用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)抽提的基因組DNA檢測(cè)其完整性，并檢驗(yàn)濃度和純度。其次，指定V3及V4可變區(qū)域并合成帶有barcode的特異引物。擴(kuò)增體系具體為：5×FastPfu Buffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、Forward Primer (5 μmol/L) 0.8 μL、Reverse Primer (5 μmol/L) 0.8 μL、FastPfu Polymerase 0.4 μL、Template DNA 10 ng、補(bǔ)充dd H2O至20 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，循環(huán)27次；72 ℃ 10 min。每個(gè)樣本重復(fù)3次，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN，美國(guó))對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠并回收，Tris-HCl洗脫。利用2%瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè)，參照電泳初步定量結(jié)果，利用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega，美國(guó))對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，按照每一個(gè)樣本的測(cè)序量要求進(jìn)行對(duì)應(yīng)比例的混合[8-9]。

1.3.2文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序：區(qū)分樣本后采用Illumina平臺(tái)構(gòu)建文庫(kù)并進(jìn)行16S rRNA腸菌測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

與去勢(shì)前BMD比較，雌性SD大鼠去勢(shì)后12周的全身骨密度顯著下降(P<0.05)(圖1)，表明I型骨質(zhì)疏松大鼠模型構(gòu)建成功。

圖1 去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立去勢(shì)前與去勢(shì)后12周的大鼠全身骨密度比較(P<0.05)。Fig.1 The establishment of ovariectomized rat model: comparison of total BMD between pre- and 12 weeks post-ovariectomy (P<0.05)

2.1 門(mén)(phylum)級(jí)別的物種差異變化

為了比較去勢(shì)前和去勢(shì)后不同時(shí)間點(diǎn)的大鼠的腸道菌群的物種差異，我們首先對(duì)比了24個(gè)樣本(4組，n=6)中的腸道菌群在腸菌的門(mén)(phylum)級(jí)別的物種組成(圖2)。結(jié)果顯示，厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)是腸道菌群的主要構(gòu)成腸菌，無(wú)論在去勢(shì)前或去勢(shì)后，二者含量之和均超過(guò)腸道菌群總量的90%。其中，厚壁菌門(mén)在去勢(shì)后出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)，一直持續(xù)到術(shù)后8周。然而，厚壁菌門(mén)的含量隨后出現(xiàn)了明顯的增加，并且這種增加和去勢(shì)前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與此相反，擬桿菌門(mén)的含量在去勢(shì)后逐漸增加，一直持續(xù)到術(shù)后8周，隨后其含量顯著下降。變形菌門(mén)的含量沒(méi)有出現(xiàn)顯著性的變化(P>0.05)。

圖2 門(mén)(phylum)級(jí)別的物種差異變化Fig.2 Abundance difference in phylum level of gut microbiota

2.2 綱(class)級(jí)別的物種差異變化

綱是隸屬于門(mén)的分類(lèi)級(jí)別，通過(guò)比較綱級(jí)別的物種差異能夠進(jìn)一步細(xì)化腸菌變化特征(圖3)。梭菌綱(厚壁菌門(mén))和擬桿菌綱(擬桿菌門(mén))是含量最大的腸道菌群。梭菌綱的含量變化趨勢(shì)和厚壁菌門(mén)基本一致，在去勢(shì)后下降并持續(xù)到術(shù)后8周；同樣，在術(shù)后12周其含量顯著增高。類(lèi)似的，擬桿菌綱的含量變化趨勢(shì)和擬桿菌門(mén)趨于一致。芽孢桿菌綱(厚壁菌門(mén))在去勢(shì)術(shù)后8周顯著增多。

2.3 目(order)級(jí)別的物種差異變化

在目級(jí)別的腸道菌群構(gòu)成上，梭菌目(梭菌綱)和擬桿菌目(擬桿菌綱)則是主要的腸道菌群(圖4)。梭菌目的變化規(guī)律和梭菌綱、厚壁菌門(mén)在各自級(jí)別的腸道菌群構(gòu)成的變化規(guī)律趨于一致。而擬桿菌目的變化規(guī)律則和擬桿菌綱、擬桿菌門(mén)在各自級(jí)別的變化趨勢(shì)相似。另外，乳桿菌目在去勢(shì)12周時(shí)其含量顯著增加。

2.4 科(family)級(jí)別的物種差異變化

圖3 綱(class)級(jí)別的物種差異變化Fig.3 Abundance difference in class level of gut microbiota

圖4 目(order)級(jí)別的物種差異變化Fig.4 Abundance difference in order level of gut microbiota

圖5 科(family)級(jí)別的物種差異變化Fig.5 Abundance difference in family level of gut microbiota

隨著腸菌分類(lèi)級(jí)別的細(xì)化，去勢(shì)大鼠的科級(jí)別的腸道菌群出現(xiàn)了較為復(fù)雜的變化(圖5)。首先，毛螺旋菌科(梭菌目)、s24-7(擬桿菌目)和瘤胃菌球科(梭菌目)是腸道菌群的主要構(gòu)成腸菌。其次，毛螺旋菌科(去勢(shì)前：53.1%)在去勢(shì)后其含量顯著降低(去勢(shì)后4周：22.0%)，一直持續(xù)到術(shù)后8周(24.4%)，隨后其含量逐漸增高(去勢(shì)后12周：48.7%)。S24-7去勢(shì)后含量逐漸增加，而8周后其含量降低。瘤胃菌球科的含量在去勢(shì)后逐漸增加(去勢(shì)后12周：18.0%)。普雷沃氏菌科在去勢(shì)后12周顯著降低(P<0.05)。

2.5 屬(genus)和種(species)級(jí)別的物種差異變化

16S rRNA 測(cè)序法的優(yōu)勢(shì)在于測(cè)序結(jié)合保守區(qū)和可變區(qū)，能夠?qū)⒒蛐蛄袦?zhǔn)確地歸類(lèi)到屬級(jí)別。加以更加嚴(yán)格的對(duì)比條件，可以分析出樣本間的種級(jí)別差異(表1)。與術(shù)前比較，普雷沃氏菌屬(普雷沃氏菌科)、Odoribacter 含量在術(shù)后12周明顯降低(P<0.05)。而螺桿菌屬(螺桿菌科-彎曲菌目-ε變形菌綱-變形菌門(mén))與Alistipes在術(shù)后12周含量增多(P<0.05)。在種級(jí)別的分類(lèi)中，白色瘤胃球菌在術(shù)后12周顯著增多(P<0.05)。相反，單形擬桿菌含量顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

項(xiàng)目術(shù)前/(%)術(shù)后12周/(%)P值普雷沃氏菌屬6.1670±2.04300.7633±0.07470.045 螺桿菌屬0.0416±0.01300.3933±0.11460.027 YS20.0516±0.01010.0200±0.00730.031 Odoribacter0.0600±0.01090.0233±0.00550.019 Alistipes0.0216±0.00470.1300±0.03530.027

項(xiàng)目術(shù)前/(%)術(shù)后12周/(%)P值白色瘤胃球菌0.2139±0.04930.4368±0.06160.006 單形擬桿菌 0.0165±0.00850.0083±0.00210.005

3 討論

胃腸道內(nèi)富含人體內(nèi)種類(lèi)最多、密度最大的微生物群落，按照界、門(mén)、綱、目、科、屬、種分類(lèi)[10]。闡明腸道菌群及其代謝產(chǎn)物在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)病過(guò)程中的變化規(guī)律和結(jié)構(gòu)特征，是深入了解腸道菌群調(diào)節(jié)機(jī)制的重要前提。臨床研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者的腸道菌群OTUs數(shù)量與Alpha多樣性高于對(duì)照組[8-9]。然而，也有研究顯示低骨量人群的OTUs和腸菌種類(lèi)的數(shù)量低于對(duì)照組[11]。上述研究結(jié)果不一致的原因可能和其臨床試驗(yàn)的入排標(biāo)準(zhǔn)、病例數(shù)量、性別比例等差異有關(guān)[12]。目前，腸道菌群在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)病過(guò)程中的時(shí)間變化規(guī)律尚未完全闡明。

本研究通過(guò)去勢(shì)法構(gòu)建I型骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，其優(yōu)點(diǎn)是該模型是經(jīng)典的I型骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)研究使用的動(dòng)物模型，其試驗(yàn)動(dòng)物間的個(gè)體差異較小。本研究發(fā)現(xiàn)，雌性大鼠去勢(shì)后，厚壁菌門(mén)的梭菌綱的梭菌目的毛螺旋菌科的螺桿菌屬，以及厚壁菌門(mén)的梭菌綱的梭菌目的瘤胃球菌科的白色瘤胃球菌屬，其含量在去勢(shì)后顯著增多，而擬桿菌門(mén)的擬桿菌綱的擬桿菌目的普雷沃菌科的普雷沃菌屬含量顯著下降。

16S rRNA測(cè)序技術(shù)是目前微生物系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)研究中鑒定腸道菌群的常用方法。我們發(fā)現(xiàn)在去勢(shì)后12周時(shí)，白色瘤胃球菌含量顯著增多，而單形擬桿菌的含量顯著降低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雖然本研究不能證實(shí)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和這些腸菌含量變化之間的因果關(guān)系，未來(lái)應(yīng)進(jìn)一步利用腸菌移植等方法研究這些腸菌對(duì)骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的作用與影響，闡明特異腸菌對(duì)機(jī)體骨量變化的影響。在種(species)級(jí)別的腸道菌群測(cè)序上，宏基因組學(xué)的優(yōu)勢(shì)在于其測(cè)序程度更深以及可測(cè)序列更加完整，但價(jià)格昂貴。因此，未來(lái)需進(jìn)一步結(jié)合宏基因組學(xué)測(cè)序技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證腸道菌群與骨質(zhì)疏松癥的內(nèi)在關(guān)系。

綜上所述，I型骨質(zhì)疏松的腸道菌群數(shù)量和結(jié)構(gòu)組成在門(mén)、綱、目等級(jí)別上發(fā)生了顯著性改變，為研究腸道菌群和骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系提供理論依據(jù)。