趙甜甜，范會(huì)芬，孫天杰，肖付明，張 潔，王冬梅

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001；2.河北省邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河北 邯鄲 056001）

土壤鹽堿化是嚴(yán)重影響大豆生長與產(chǎn)量的因素之一。不同研究者發(fā)現(xiàn)植物耐鹽性調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，且具有多基因控制同一性狀的特點(diǎn)。因此，借助基因工程技術(shù)，通過改變一個(gè)或幾個(gè)耐鹽基因的表達(dá)量，可以更加精確、穩(wěn)定和快速地改良作物的耐鹽性［1］。位于液泡膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,具有將鹽脅迫條件下植物吸收的過多Na+轉(zhuǎn)運(yùn)至植物液泡中的功能,在維持植物在高鹽條件下原生質(zhì)中的內(nèi)穩(wěn)態(tài)和抵御鹽分危害中具有重要作用［2］。在高鹽環(huán)境下，植物通過保持胞質(zhì)內(nèi)低Na+濃度來實(shí)現(xiàn)自我保護(hù)，其主要措施有3 種：拒Na+、Na+的外排和Na+的區(qū)隔化［3］。在植物中，Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以將Na+排到胞外或者將Na+區(qū)隔至液泡或其他細(xì)胞器，如高爾基體等，從而維持胞內(nèi)Na+含量穩(wěn)定及Na+/H+相對(duì)平衡，減少鹽堿對(duì)植物的傷害。H+-焦磷酸酶是一種獨(dú)特的質(zhì)子泵，僅由1 條多肽鏈組成，分子量約為80 kD，以焦磷酸為底物，該酶定位在植物細(xì)胞的液泡膜上［4］。H+-焦磷酸酶是研究高能磷酸鍵水解與質(zhì)子轉(zhuǎn)位之間偶聯(lián)機(jī)理的一種模型，其在液泡膜上的定位與H+-焦磷酸酶的生理功能密切相關(guān)［5］。H+-焦磷酸酶在植物抵御鹽［6-9］、干旱［10］、礦物營養(yǎng)元素匱乏［11-12］和低溫［13-14］等非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用。已有研究表明，將具有Na+外排和區(qū)隔化作用的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NHX）和能夠?yàn)槠涮峁┛缫号菽+梯度驅(qū)動(dòng)力的液泡膜H+-焦磷酸酶（VP）共轉(zhuǎn)化可以明顯提高植物抗鹽性［15］。課題組前期克隆得到了大豆GmNHX1 基因，初步證明該基因能夠提高擬南芥的抗鹽性并且恢復(fù)酵母nhx1 鹽敏感突變體菌株的耐鹽性［16］。本研究從大豆耐鹽品種‘冀豆7 號(hào)’中克隆得到液泡膜H+-焦磷酸酶基因GmVP1，利用大豆發(fā)狀根轉(zhuǎn)化體系，初步驗(yàn)證其耐鹽功能；在此基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建GmVP1 和GmNHX1 雙價(jià)基因植物表達(dá)載體，進(jìn)一步驗(yàn)證雙基因轉(zhuǎn)化是否能夠更有效地提高大豆耐鹽性，為利用雙價(jià)基因轉(zhuǎn)化體系培育優(yōu)質(zhì)抗鹽大豆新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用河北省優(yōu)良大豆品種‘冀豆7 號(hào)’和鹽敏感品種‘五星2 號(hào)’［17］，農(nóng)桿菌菌株K599 及植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA3301，以上材料均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物逆境研究室提供。克隆載體pEASY?-Blunt Cloning Vector、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1 購自北京全式金生物科技有限公司。

載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌培養(yǎng)使用的主要培養(yǎng)基參見劉海坤［18］；發(fā)狀根培養(yǎng)使用的主要培養(yǎng)基參見黃姍［8］的方法。

1.2 鹽脅迫條件下大豆液泡膜 H+-焦磷酸酶基因的表達(dá)量分析

根據(jù)擬南芥液泡膜 H+- 焦磷酸酶基因AtVP1的序列信息在NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)，找到大豆中同源性最高的序列LOC100794166，根據(jù)該基因序列設(shè)計(jì)引物（ 上游引物：5'-CCGGGGCTCTAGTTTCTGGC -3'，下游引物： 5'-CCCCAATAACAGCTGCCTTG -3'），選用EF1A基因作為內(nèi)參基因，序列信息參見文獻(xiàn)［19］，利用RNAiso Plus 試劑分別提取 0、35、70、105、140、175、200 mmol/LNaCl 處理?xiàng)l件下的‘冀豆7號(hào)’和‘五星2 號(hào)’葉片 RNA（參見Takara 公司RNAiso Plus 說明書），利用RT-qPCR 檢測不同鹽脅迫處理?xiàng)l件下大豆GmVP1 基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.3 目的基因的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建

‘冀豆7 號(hào)’種子萌發(fā)至第2 輪三葉長出時(shí)，提取葉片總RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用PCR 技術(shù)擴(kuò)增GmVP1 基因。目的基因引物序列為：上游引物為5'- acgggggactcttgaCCATGGttATGGGTGCTGC TCTGCTGT -3'，下游引物為5'- gggaaattcgagctGG TGACCTCAAAAGATCTTGAAAAGCAGGCCACC -3'。反應(yīng)體系參見Prime STAR Max Premix 產(chǎn)品說明書，反應(yīng)條件為：98 ℃ 2 min、98 ℃ 10 s、 55 ℃ 15 s、72 ℃ 2 min、30 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。

從GmVP1 基因測序正確的大腸桿菌中提取質(zhì)粒，用Nco Ⅰ和EcoO65Ⅰ對(duì)其進(jìn)行雙酶切，將得到的GmVP1 基因大片段與pCAMBIA3301 質(zhì)粒載體連接，經(jīng)雙酶切鑒定成功后，轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌菌株K599。利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建好的pCAMBIA3301-GmNHX1， 設(shè) 計(jì) 引 物 擴(kuò) 增GmNHX1 基 因 前 面CaMV35S 強(qiáng)啟動(dòng)子、后面Nos 終止子和目的基因序列，利用BamHⅠ及SacⅠ雙酶切后，連接到pCAMBIA3301-GmVP1 載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)域，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取平板上陽性菌落，37 ℃條件下180 r/min 震蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和SacⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌菌株K599。構(gòu)建的載體圖譜如圖1 所示。

圖1 pCAMBIA3301-GmVP1、pCAMBIA3301-GmVP1-GmNHX1 載體的構(gòu)建圖譜Fig.1 Construction of vector pCAMBIA3301-GmVP1 and pCAMBIA3301-GmVP1-GmNHX1

1.4 大豆發(fā)狀根的制備及轉(zhuǎn)化

發(fā)根農(nóng)桿菌的大豆遺傳轉(zhuǎn)化參見文獻(xiàn)［9］的方法。

1.5 轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根的檢測

按照王月月新改良的CTAB 法方法提取大豆基因組DNA［20］，以Bar 基因區(qū)段特異引物進(jìn) 行PCR 擴(kuò) 增， 引 物 序 列 為： 上 游 引 物：5'- CAAATCTCGGTGACGGGC -3'， 下 游 引 物：5'- GCACCATCGTCAACCACTAC -3'。 采 用94 ℃ 5 min、94 ℃30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 140 s 的 PCR 程序，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)后，72 ℃ 10 min，擴(kuò)增480 bp 片段。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。

用Bar 免疫性試紙條檢驗(yàn)大豆發(fā)狀根，操作方法參見杭州港隆生物轉(zhuǎn)基因EPSPS 速測試紙說明書進(jìn)行。

1.6 轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的耐鹽性分析

將經(jīng)過Basta 篩選，并經(jīng) PCR 和免疫性試紙檢測驗(yàn)證的大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根和非轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根，分別轉(zhuǎn)移到NaCl 濃度分別為0、70 和150 mmol/L 的添加6 mg/L Basta、200 mg/L Cef 的1/2 MS 固體培養(yǎng)基中。經(jīng)15 d 培養(yǎng)后，觀察記錄發(fā)狀根的生長情況，并統(tǒng)計(jì)發(fā)狀根數(shù)量以及最大根長。以不含外源表達(dá)載體的 K599 菌株侵染產(chǎn)生的發(fā)狀根作對(duì)照，均設(shè)3 次重復(fù)。

1.7 轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根POD 和SOD 活性及MDA 含量的測定

大豆發(fā)狀根的POD 酶活性測定、SOD 酶活性測定、MDA 含量測定按照文獻(xiàn)［9］中的方法進(jìn)行操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的表達(dá)分析

根據(jù)擬南芥液泡膜 H+- 焦磷酸酶基因AtVP1（Arabidopsislyrata subsp. lyrata vacuolar-type H+pumping pyrophosphatase 1）的序列信息在NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)，找到大豆中同源性最高的序 列：DEFINITION PREDICTED: Glycine max pyrophosphate-energized vacuolar membrane proton pump (LOC100794166)，根據(jù)該基因序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-qPCR 檢測了鹽脅迫處理?xiàng)l件下大豆GmVP1基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，經(jīng)不同濃度NaCl 處理 12 h，抗鹽品種‘冀豆7 號(hào)’中GmVP1 的表達(dá)量在35 ～140 mmol/LNaCl 濃度下呈現(xiàn)較高水平表達(dá)，而在鹽敏感品種‘五星2 號(hào)’中GmVP1 的表達(dá)量隨NaCl 濃度的升高變化不明顯，相較對(duì)照略有下降（見圖2）。初步證明GmVP1 在轉(zhuǎn)錄水平響應(yīng)鹽脅迫，可能在大豆抵御鹽脅迫過程中發(fā)揮重要作用。

圖2 大豆鹽脅迫處理?xiàng)l件下GmVP1 的表達(dá)模式Fig.2 Expression patterns of GmVP1 after treatment with NaCl

2.2 GmVP1 基因的克隆與pCAMBIA3301-GmVP1-GmNHX1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

為進(jìn)一步驗(yàn)證該基因的功能， 根據(jù)LOC100794166 序列信息設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行同源克隆，其產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物大小為2307 bp。經(jīng)測序驗(yàn)證后與LOC100794166 進(jìn)行蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在第18 位由V 變?yōu)锳、第568 位由L 變?yōu)镾，序列同源率達(dá)到99.74%，個(gè)別氨基酸的差異可能是由于不同大豆品種間存在差異所致。生信分析表明，該基因的蛋白序列與擬南芥AVP1 相似度最高（90.2%），而擬南芥AVP1 屬于Ⅰ型H+-焦磷酸酶，故將本試驗(yàn)克隆的基因命名為GmVP1。

將GmVP1 基因片段連接到雙元表達(dá)載體pCAMBIA3301 中，利用Nco Ⅰ和Eco O65 Ⅰ對(duì)構(gòu)建好的pCAMBIA3301-GmVP1 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定（見圖3），表明pCAMBIA3301-GmVP1 植物雙元表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖3 pCAMBIA3301-GmVP1 雙酶切鑒定圖譜Fig.3 Digestion of pCAMBIA3301-GmVP1 plasmid with double restriction enzymes

利用本實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建好的pCAMBIA3301-GmNHX1 載體，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增GmNHX1 基因前面CaMV35S 強(qiáng)啟動(dòng)子、后面Nos 終止子和目的基因序列，構(gòu)建到pCAMBIA3301-GmVP1 載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)域（構(gòu)建后的載體圖譜如圖1 所示），經(jīng)BamH Ⅰ和Sac Ⅰ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，酶切結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致（見圖4），表明pCAMBIA3301-GmVP1-GmNHX1 植物雙元表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖4 pCAMBIA3301-GmVP1-GmNHX1 雙酶切鑒定圖譜Fig.4 Digestion of pCAMBIA3301-GmVP1-GmNHX1 plasmid with double restriction enzymes

2.3 轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的分子生物學(xué)鑒定

將酶切驗(yàn)證正確的pCAMBIA3301-GmVP1 載體和pCAMBIA3301-GmVP1-GmNHX1 載體以及對(duì)照載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌菌株K599，然后進(jìn)行大豆‘五星2 號(hào)’子葉轉(zhuǎn)化。在含有6 mg/L Basta 的RM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d，得到生長狀態(tài)良好的發(fā)狀根。取未經(jīng)Basta 處理的由K599 空菌侵染子葉產(chǎn)生的發(fā)狀根（CK）和具有Basta 抗性的發(fā)狀根，提取基因組DNA，經(jīng)PCR 擴(kuò)增Bar 基因部分序列（如圖5 ～6 所示），證明轉(zhuǎn)化的發(fā)狀根均呈現(xiàn)陽性，說明 攜 帶pCAMBIA3301、pCAMBIA3301-GmVP1、pCAMBIA3301-GmVP1-GmNHX1 載體的發(fā)根農(nóng)桿菌已成功轉(zhuǎn)入大豆；進(jìn)一步利用Bar 蛋白的免疫試紙條對(duì)發(fā)狀根進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)所驗(yàn)證的發(fā)狀根均檢測到Bar 蛋白的免疫條帶（見圖7），說明在轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根中由35S 啟動(dòng)子調(diào)控的GmVP1 基因和GmVP1-GmNHX1 雙價(jià)基因均已成功在蛋白質(zhì)水平表達(dá)。

圖5 轉(zhuǎn)pCAMBIA3301-GmVP1 發(fā)狀根的PCR 檢測Fig.5 PCR detection of transgenic pCAMBIA3301-GmVP1 hairy roots

圖6 轉(zhuǎn)pCAMBIA3301-GmVP1-GmNHX1 發(fā)狀根的PCR 檢測Fig.6 PCR detection of transgenic pCAMBIA3301-GmVP1-GmNHX1 hairy roots

圖7 轉(zhuǎn)化發(fā)狀根的Bar 特異性試紙檢測Fig.7 Bar-specific strip test for transforming hairy roots

2.4 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的表型鑒定

以‘五星2 號(hào)’大豆品種為材料，將共培養(yǎng)后 的pCAMBIA3301、pCAMBIA3301-GmVP1、pCAMBIA3301-GmVP1-GmNHX1 大豆子葉轉(zhuǎn)接于分別含有0、70、150 mmol/LNaCl 的RM 培養(yǎng)基中進(jìn)行脅迫處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同濃度NaCl 處理?xiàng)l件下，不同轉(zhuǎn)化材料的發(fā)狀根的生長均受到一定程度的影響（見圖8）。經(jīng)70、150 mmol/LNaCl 處理后，轉(zhuǎn)GmVP1/GmNHX1 雙價(jià)基因的大豆發(fā)狀根的平均最大根長均明顯大于轉(zhuǎn)GmVP1 基因以及空載體對(duì)照的發(fā)狀根，且呈顯著性差異；70 mmol/LNaCl 處理時(shí)平均發(fā)根數(shù)多于轉(zhuǎn)GmVP1 基因以及對(duì)照，差異顯著；但在150 mmol/LNaCl 處理時(shí)平均發(fā)根數(shù)與轉(zhuǎn)GmVP1 基因以及對(duì)照無差異。初步證明GmVP1/GmNHX1 雙價(jià)基因過表達(dá)比GmVP1 單基因過表達(dá)更能提高大豆發(fā)狀根相對(duì)生長量及其耐鹽性。

圖8 不同NaCl 濃度處理下pCAMBIA3301-GmVP1-GmNHX1 發(fā)狀根表型Fig.8 Hairy root phenotype of pCAMBIA3301-GmVP1-GmNHX1 treated with different NaCl concentration

2.5 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的生理指標(biāo)檢測

單獨(dú)轉(zhuǎn)化GmVP1 基因的發(fā)狀根，在70 mmol/L NaCl 濃度下POD 酶活性明顯高于轉(zhuǎn)空載體對(duì)照，在150 mmol/LNaCl 濃度下SOD 酶活性明顯高于轉(zhuǎn)空載體對(duì)照，并且MDA 的含量在2 個(gè)不同鹽濃度處理?xiàng)l件下均明顯低于對(duì)照。而轉(zhuǎn)GmVP1/GmNHX1雙價(jià)基因的發(fā)狀根POD 酶活性在70、150 mmol/L NaCl 濃度下均高于轉(zhuǎn)GmVP1 單價(jià)基因的發(fā)狀根及對(duì)照；在70 mmol/LNaCl 濃度下，轉(zhuǎn)GmVP1/GmNHX1 雙價(jià)基因的發(fā)狀根SOD 酶活性均明顯高于單獨(dú)轉(zhuǎn)化GmVP1 基因以及空載體的對(duì)照，在150 mmol/LNaCl 濃度條件下明顯高于空載體對(duì)照，但是與單獨(dú)轉(zhuǎn)化GmVP1 基因的相比不明顯；轉(zhuǎn)GmVP1/GmNHX1 雙價(jià)基因發(fā)狀根的MDA 含量，在70 mmol/LNaCl 濃度下明顯低于對(duì)照但高于單獨(dú)轉(zhuǎn)化GmVP1 基因，在150 mmol/LNaCl 濃度下均低于轉(zhuǎn)GmVP1 基因和空載體對(duì)照(見圖9—11)。進(jìn)一步說明GmVP1/GmNHX1 雙價(jià)基因與單獨(dú)轉(zhuǎn)化GmVP1 基因相比能夠更有效地降低鹽脅迫對(duì)細(xì)胞造成的傷害，并增強(qiáng)大豆發(fā)狀根抵御鹽脅迫的能力。

圖9 不同NaCl 濃度處理下轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根POD 活性測定Fig.9 Determination of POD in roots of transgenic roots treated with different NaCl concentration

圖10 不同NaCl 濃度處理下轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根SOD 活性測定Fig.10 Determination of transgenic hairy root SOD at different NaCl concentration

圖11 不同NaCl 濃度處理下轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根MDA 含量測定Fig.11 MDA determination of transgenic hairy roots under different NaCl concentration

3 討論與結(jié)論

3.1 VP 基因在植物抵御鹽脅迫過程中的作用

根據(jù)對(duì)不同陽離子的敏感程度及同源性相關(guān)程度，擬南芥H+- 焦磷酸酶被分為兩種類型：Ⅰ型H+-焦磷酸酶對(duì)K+敏感，代表基因?yàn)锳VP1；Ⅱ型H+-焦磷酸酶對(duì)K+不敏感而對(duì)Ca2+敏感，代表基因?yàn)锳VP2［21］。Sarafian 等人率先從擬南芥中克隆了第一個(gè)H+-焦磷酸酶的cDNA（數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)M81892）［22］。已有大量研究表明，在擬南芥、棉花、白三葉等多種植物中的焦磷酸酶基因均表現(xiàn)出一定的抗鹽功能［6-8,23］。但在大豆中關(guān)于VP 基因的相關(guān)研究還很少。黃姍克隆得到了與擬南芥AVP2相似度高的大豆H+-焦磷酸酶基因GmVP，其編碼蛋白屬于Ⅱ型H+-焦磷酸酶，證明大豆H+-焦磷酸酶基因GmVP 過表達(dá)能提高鹽脅迫下大豆發(fā)狀根的相對(duì)伸長率，提高發(fā)狀根的耐鹽性［9］，本研究根據(jù)序列信息克隆得到大豆液泡膜H+-焦磷酸酶基因，經(jīng)生信分析該基因與擬南芥AVP1 相似度最高，其編碼蛋白可能屬于Ⅰ型H+-焦磷酸酶，故將之命名為GmVP1。

有研究表明，液泡膜焦磷酸酶基因GmVP 在大豆耐鹽品種‘文豐7 號(hào)’中，經(jīng)NaCl 處理后1、8和24 h 其表達(dá)量高于對(duì)照，而在鹽敏感品種‘Union’中，經(jīng)NaCl 處理3 h 后上調(diào)表達(dá)而后呈下調(diào)表達(dá)，且表達(dá)量低于對(duì)照［9］。并且，GmVP 表達(dá)量還受到ABA、PEG 等物質(zhì)的影響，初步證明GmVP 響應(yīng)鹽堿、植物激素與干旱脅迫［9］。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同濃度NaCl 處理后，在抗鹽品種‘冀豆7 號(hào)’中GmVP1 的表達(dá)量隨NaCl 濃度的升高整體呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，而在鹽敏感品種‘五星2 號(hào)’中GmVP1 的表達(dá)量變化不明顯且整體呈現(xiàn)較低的表達(dá)水平。推測隨著鹽濃度增加，耐鹽品種中GmVP1呈較高水平表達(dá)，產(chǎn)生了更多的跨膜質(zhì)子梯度，為液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提供了更大的驅(qū)動(dòng)力，進(jìn)而有助于細(xì)胞將鈉離子區(qū)隔化到液泡中，減輕高鹽濃度對(duì)細(xì)胞的傷害，其詳細(xì)作用機(jī)制有待深入探討。

3.2 雙價(jià)基因轉(zhuǎn)化在提高植物耐鹽中的應(yīng)用

植物的耐鹽性是受多基因控制和環(huán)境綜合影響的數(shù)量性狀，將多價(jià)基因共轉(zhuǎn)化應(yīng)用于植物耐鹽性狀的改良，具有巨大發(fā)展?jié)摿Α＝陙?，多?xiàng)研究表明雙基因共轉(zhuǎn)化可提高植物耐鹽性［24-25］。其中，將NHX 和VP 兩種基因構(gòu)建雙價(jià)表達(dá)載體，進(jìn)行雙基因共轉(zhuǎn)化，比單基因轉(zhuǎn)化抗鹽效果更佳［26-27］。有研究表明，單獨(dú)提高液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或H+-PPase 表達(dá)量后，均能夠提高轉(zhuǎn)基因棉花的耐鹽能力［28］；而將大豆液泡膜 Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GmNHX1 和百脈根液泡膜H+-PPaseLcVP1 雙價(jià)基因整合到棉花基因組后，不同程度地提高了轉(zhuǎn)基因株系耐鹽能力，進(jìn)一步證明二者共表達(dá)有助于提高棉花的抗鹽能力。另外，Bao 等從旱生植物霸王中克隆到的液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和 H+-PPase 編碼基因ZxNHX1 和ZxVP1-1 聚合導(dǎo)入紫花苜蓿，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽性、抗旱性和耐貧瘠性均顯著增強(qiáng)［15,24,27］，并且T2 代共表達(dá)ZxNHX1和ZxVP1-1 轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿穩(wěn)定遺傳了T0和T1代轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽抗旱性［29］。本研究將GmNHX1和GmVP1 構(gòu)建在同一載體，獲得了轉(zhuǎn)雙價(jià)基因的大豆發(fā)狀根。經(jīng)不同濃度的NaCl 處理后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化GmVP1 和GmNHX1 雙價(jià)基因的大豆發(fā)狀根比轉(zhuǎn)化GmVP1 單基因的大豆發(fā)狀根在鹽脅迫下具有更長的生長量，更強(qiáng)的POD 等保護(hù)酶酶活性，進(jìn)一步印證了雙價(jià)轉(zhuǎn)化比單獨(dú)轉(zhuǎn)化具有更高的抗鹽效率。