孫 甜 呂業(yè)超 唐小牛 湛孝東 姜玉新

1.皖南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)寄生蟲學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002； 2.嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，浙江 嘉興 314001

過敏性哮喘是常見的由多種細胞及細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，全球多達3億人受到影響，發(fā)病率逐年上升且臨床治療效果不佳[1]。其主要特征是血清IgE和細胞因子水平升高、氣道嗜酸性粒細胞增多、粘液積聚、氣道高反應(yīng)性及可逆的氣道重塑[2-3]。肺泡巨噬細胞作為肺部微環(huán)境中數(shù)量最多的炎癥細胞參與病原體的識別、攝取和殺傷，在機體炎癥反應(yīng)的啟動和調(diào)節(jié)以及適應(yīng)性免疫中起著重要作用[4-5]。脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是革蘭氏陰性細菌外膜的主要成分。研究表明，LPS可以刺激巨噬細胞中炎性介質(zhì)及炎性細胞因子(如NO、TNF-α和IL-6、IL-1β)的分泌，從而導(dǎo)致肺損傷和氣道重塑加劇，加重炎癥反應(yīng)[7]。因此，LPS刺激巨噬細胞被廣泛應(yīng)用于研究過敏性哮喘等炎癥性疾病。

草烏甲素(Bulleyaconitine A,BLA)是一種從烏頭屬植物中分離的二萜類生物堿，據(jù)報道具有抗炎、鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)活性[8-9]。我們前期研究結(jié)果表明草烏甲素可緩解過敏性哮喘小鼠的氣道炎癥反應(yīng)，但其具體的分子機理尚不十分清楚。鑒于此，本研究擬以LPS刺激小鼠巨噬細胞RAW264.7為炎癥模型，旨在從細胞水平上進一步闡明草烏甲素的抗炎機制，從而為草烏甲素對過敏性哮喘的治療提供更多實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要材料與試劑

小鼠腹腔巨噬細胞系RAW264.7由皖南醫(yī)學(xué)院中心實驗室贈與；草烏甲素標(biāo)準(zhǔn)品(BLA)(編號CAS#107668-79-1)購自上海源葉生物科技有限公司；脂多糖(LPS)(編號L2880-O55:B5)購自美國Sigma公司；DMEM完全培養(yǎng)液購自美國Gibco公司(編號REF:C11965500BT)；CCK-8細胞活力/毒性檢測試劑盒購自合肥睿捷生物科技有限公司(編號REF: BL001B)；IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1 ELISA檢測試劑盒(編號分別為REF: AE90247Mu；REF:AE90731Mu；REF:AE90301Mu；CSB-E07430m)購自美國Amresco公司；兔抗iNOS、COX-2、TLR4、NF-κBp65、p38MAPK、ERK和JNK等多克隆抗體(編號分別為13120S、12282S、D220102-0100、8242S、8690S、4695S、9252P)購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.1.2主要儀器設(shè)備

超凈工作臺(型號SJ-CJ-2D)為上海尚凈公司產(chǎn)品；CO2細胞培養(yǎng)箱為日本SANYOMCO公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡(型號IX73)為日本OLYMPUS公司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀(型號Tecan Infinite F200)為瑞士TECAN集團公司產(chǎn)品；低溫高速離心機(型號3-18KS)為美國Sigma公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋(型號HH-3)為江蘇金壇市億通電子有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)

RAW264.7細胞于37℃、5%CO2以及95%相對濕度的培養(yǎng)箱中孵育，用含10%胎牛血清(FBS)、1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。每隔1天換液1次，待細胞鋪滿培養(yǎng)皿進行傳代或凍存。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2細胞活性檢測

將對數(shù)生長期的RAW264.7細胞制備成細胞懸液，加入6孔板，每孔100 μL細胞懸液，待細胞融合度達80%時，分別使用不同濃度的草烏甲素(0、25、50、100、150、200、400、600、800、1 000、1 500 μg/mL)處理細胞，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，將CCK-8溶液與DMEM完全培養(yǎng)液按1∶10的比例稀釋后，每孔加入100 μL稀釋液，避光在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h后終止培養(yǎng)，使用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度(OD)值。

1.2.3不同草烏甲素作用時間細胞上清液中炎癥因子的檢測

將對數(shù)生長期的RAW264.7細胞制備成細胞懸液，加入6孔板，每孔2 mL。待細胞融合度達80%時用150 μg/mL的草烏甲素預(yù)處理細胞2 h，然后每孔加入500 ng/mL的LPS刺激細胞，在草烏甲素作用時間分別為0、0.5、1、2、3、4、5、6、8、12、16、18、20、24、30、48 h時終止培養(yǎng)并收集細胞上清液，用ELISA試劑盒檢測IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1含量，具體操作按照說明書進行。

1.2.4Western blot檢測草烏甲素對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞信號通路的影響

處理方法同上，在草烏甲素作用時間分別為0、2、6、12、18、24 h時終止培養(yǎng)，收集細胞并提取總蛋白-20℃保存?zhèn)溆?。取等量樣品行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至NC膜；5%BSA封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3遍，每遍10 min；二抗孵育40 min，TBST洗膜3遍，每遍10 min，ECL發(fā)光試劑盒曝光成像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 草烏甲素對RAW264.7細胞活力的影響

CCK-8結(jié)果(圖1)表明25、50、100、150 μg/mL的草烏甲素作用于RAW264.7細胞24 h對其活力沒有顯著影響，而200、400、600、800、1 000、1 500 μg/mL的草烏甲素作用于細胞24 h對其增殖活力有顯著的抑制作用，因此后續(xù)實驗使用150 μg/mL的草烏甲素處理細胞。

圖1 草烏甲素對RAW264.7細胞活力的影響(a,P < 0.05 vs.對照組)

2.2 不同草烏甲素作用時間對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞炎癥因子含量的影響

為了了解草烏甲素對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞炎癥因子釋放的影響，我們檢測了炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α以及MCP-1的水平。其結(jié)果如圖2A所示：與LPS組相比，草烏甲素作用各時間段TNF-α含量均降低(P< 0.01)，其中30 h組與其他各小時組相比含量最低(P< 0.05)，而30 h組與48 h組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)；圖2B顯示：與LPS組相比，草烏甲素作用各時間段IL-1β含量均降低(P< 0.01)，其中5 h組與6、16、18、20、30、36 h組相比IL-1β含量更低(P< 0.05)；圖2C顯示與LPS組相比，除3、4 、16和20 h差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其他各作用時間段IL-6含量均降低(P< 0.05)；圖2D顯示與LPS組相比，除0.5h和2 h差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其他各作用時間段MCP-1含量均降低(P< 0.05)。

2.3 草烏甲素對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞中iNOS和COX-2表達水平的影響

在本研究中，通過Western blot檢測iNOS和COX-2的表達。結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS顯著增加iNOS和COX-2的表達。然而，用150 μg/mL的草烏甲素分別處理細胞2、6、12、18、24 h均可降低iNOS和COX-2的表達(P<0.01)，其中與其他各作用時間組相比草烏甲素作用時間48 h抑制效果最好(圖3)?？傊?，結(jié)果顯示草烏甲素可以抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞中iNOS和COX-2的表達水平。

2.4 草烏甲素對LPS誘導(dǎo)的TLR4和NF-κB通路活化的影響

通過Western blot檢測TLR4和NF-κBp65的表達。結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS顯著增加TLR4的表達以及NF-κBp65的磷酸化。然而，用150 μg/mL的草烏甲素分別處理細胞2、6、12、18、24 h均可降低TLR4的表達并降低NF-κBp65的磷酸化，其中與其他各作用時間組相比草烏甲素作用時間48 h抑制效果最好(圖4)?？傊?，結(jié)果顯示草烏甲素可以抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞中TLR4的表達以及NF-κB的活化。

2.5 草烏甲素對LPS誘導(dǎo)的MAPK通路活化的影響

通過Western blot檢測BLA對MAPK通路活化的影響。結(jié)果顯示LPS顯著增加p38、細胞外受體激酶(ERK)和c-Jun-N末端激酶(JNK)的磷酸化。然而，用草烏甲素分別作用于細胞2、6、12、18、24 h抑制了p38、ERK和JNK的磷酸化，其中與其他各作用時間組相比草烏甲素作用時間48 h抑制效果最好(圖5)?？傊?，結(jié)果顯示草烏甲素可有效抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞中MAPK信號通路的活化。

A：a，與LPS組相比，P<0.01；b，與30 h組相比，P<0.01；c,與30 h組相比，P<0.05。B：a，與LPS組相比，P<0.01；b，與5 h組相比，P<0.05。C：a，與LPS組相比，P<0.05。D：a, 與LPS組相比，P<0.05。

圖2 不同草烏甲素作用時間對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞中炎癥因子釋放的影響

A：a，與對照組相比，P<0.01；b，與LPS組相比，P<0.01; c，與18 h組相比，P<0.01。B：a，與對照組相比，P<0.01；b，與LPS組相比，P<0.05；c，與18 h組相比，P<0.01。

圖3 草烏甲素抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS和COX-2表達水平

A：a，與對照組相比，P<0.01；b，與LPS組相比，P<0.01; c，與12 h組相比，P<0.05。B：a，與對照組相比，P<0.01；b，與LPS組相比，P<0.05；c，與2 h組相比，P<0.05；d，與6 h組相比，P<0.01；e，與18 h組相比，P<0.05。

圖4 草烏甲素抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的活化和TLR4的表達

A：a，與對照組相比，P<0.01；b，與LPS組相比，P<0.01；c，與2 h組相比，P<0.01；d，與6 h組相比，P<0.05；e，與12 h組相比，P< 0.01。B：a，與對照組相比，P<0.01；b，與LPS組相比，P<0.05；c，與2 h組相比，P<0.01；d，與6 h組相比，P<0.01；e，與12 h組相比，P<0.05。C：a，與對照組相比，P<0.01；b，與LPS組相比，P<0.05；c，與2 h組相比，P<0.01；d，與6 h組相比，P<0.01；e，與12 h組相比，P<0.01。

圖5 草烏甲素抑制LPS誘導(dǎo)的p38、ERK和JNK的活化

3 討 論

巨噬細胞作為先天免疫的第一道防線，在炎癥的發(fā)生發(fā)展和消除中起關(guān)鍵作用；其通過在病原體入侵時釋放細胞因子和炎癥介質(zhì)引起先天免疫反應(yīng)[10]。炎癥期間，活化的巨噬細胞產(chǎn)生過量的炎癥介質(zhì)(如NO和TNF-α)以及炎性細胞因子(如IL-1β和IL-6)，這些物質(zhì)通過與其他炎癥介質(zhì)的協(xié)同作用促進過敏性哮喘等炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展[11]。因此，巨噬細胞廣泛用于炎癥和免疫的研究中。

草烏甲素(Bulleyaconitine A,BLA)，一種分離自烏頭屬植物的二萜類生物堿，目前對于BLA生物學(xué)活性的研究主要集中在鎮(zhèn)痛方面[12]。研究發(fā)現(xiàn)，BLA可減輕紫杉醇誘導(dǎo)的大鼠脊髓背角C-纖維突觸的神經(jīng)病理性疼痛[13]；另有研究表明BLA通過抑制蛋白激酶C(PKC)，減少神經(jīng)病理性大鼠未損傷的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中對河豚毒素敏感的鈉電流，從而緩解疼痛[14]。此外，BLA通過直接刺激脊髓小膠質(zhì)細胞中強啡肽A的表達表現(xiàn)出抗過敏反應(yīng)[15]。而據(jù)最新研究報道BLA可緩解過敏性哮喘小鼠的氣道炎癥反應(yīng)[16]，但其潛在的抗炎分子機理尚不十分清楚。

本研究首先采用CCK-8檢測了BLA對于RAW264.7細胞活力的影響，結(jié)果顯示BLA在小于等于150 μg/mL時沒有細胞毒性，因此后續(xù)實驗使用150 μg/mL的BLA處理細胞。受刺激的巨噬細胞分泌大量的炎癥介質(zhì)，包括促炎細胞因子(如IL-6、IL-1β、TNF-α)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)，導(dǎo)致炎癥細胞浸潤到氣道炎癥中，并導(dǎo)致多種免疫紊亂[17-18]。本課題通過檢測不同BLA作用時間細胞上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α以及MCP-1的水平發(fā)現(xiàn)，BLA作用不同時間均可下調(diào)它們的水平，其中BLA在作用時間48 h時對TNF-α的抑制效果最明顯。在炎癥過程中，由誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)產(chǎn)生的NO自由基在感染的先天免疫反應(yīng)中起重要作用[19]；哮喘等炎癥性疾病發(fā)生時iNOS表達通常升高[20]。環(huán)氧合酶-2(COX-2)是炎癥介質(zhì)前列腺素(PG)和白三烯等生成過程中的關(guān)鍵酶，這些炎癥介質(zhì)引起機體紅腫熱痛和炎癥細胞浸潤，從而加重現(xiàn)有的炎癥[21-22]。因此，抑制iNOS和COX-2對減輕氣道炎癥很重要。在本研究中，LPS組的iNOS和COX-2表達顯著高于對照組。然而，用BLA處理顯著降低了iNOS和COX-2表達水平，其中BLA作用48 h抑制作用最好。研究證實，NF-κBp65作為轉(zhuǎn)錄因子NF-κB家族的其中一員，在炎癥性疾病中過度激活，如過敏性哮喘[23-24]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族包括3個成員：細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)，p38MAPK和c-Jun N-末端激酶(JNK)[25]。NF-κB及MAPK作為典型的炎癥信號通路，它們能夠調(diào)節(jié)iNOS的轉(zhuǎn)錄以及相關(guān)促炎細胞因子(包括TNF-α、IL-1β和IL-6等)的表達，并在炎癥反應(yīng)中與COX-2相互作用[25-27]。LPS可通過toll樣受體4(TLR4)信號通路激活NF-κB及MAPK通路，誘導(dǎo)炎性細胞因子的產(chǎn)生，從而加重炎癥[28]。另一方面，據(jù)報道MAPK的磷酸化和活化可促進NF-κB的活化、核轉(zhuǎn)運和隨后的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[29-30]。因此，在本研究中，我們檢測了BLA對LPS刺激的NF-κB和MAPK通路活化的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS刺激可增加RAW264.7細胞TLR4的表達以及p65、p38、ERK、JNK的磷酸化；而BLA處理可降低TLR4的表達并降低p65、p38、ERK、JNK的磷酸化。這些結(jié)果表明，BLA可能通過抑制NF-κB和MAPK通路的活化減少炎癥細胞因子的產(chǎn)生來發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，本研究通過細胞實驗證明草烏甲素能夠抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞炎癥反應(yīng)，其機制可能是通過抑制TLR4、NF-κB及MAPK信號通路的活化，從而減少iNOS、COX-2和促炎細胞因子的表達實現(xiàn)的。因此，我們的研究為草烏甲素治療過敏性哮喘等炎癥性疾病提供了實驗依據(jù)，為進一步研究草烏甲素的抗炎機制奠定了基礎(chǔ)。